Etablierung einer Multiplex-qPCR zur Detektion einer Deletion des pfhrp2-Gens in Plasmodium falciparum

Abstract

Plasmodium falciparum ist Erreger der potentiell letalen Malaria tropica. In der Routinediagnostik wird die Infektion mit Mikroskopie oder Antigen-basierten Schnelltests (Rapid diagnostic tests, RDT) nachgewiesen. Diese ist Grundlage für die Therapieentscheidung und damit Teil der lebensrettenden Intervention. Ein Großteil der RDTs verwendet als Antigen P. falciparum-spezifisches Histidin-reiches Protein 2 (PfHRP2). Gamboa et al. berichteten 2010 erstmals von P. falciparum Stämmen in Peru, die durch PfHRP2-basierte RDTs nicht nachgewiesen werden konnten, weil sie durch eine Deletion des pfhrp2-Gens kein PfHRP2-Protein exprimieren. Eine daraus resultierende falsch negative Diagnostik in RDTs kann schwerwiegende Folgen haben und die Eliminierung der Malaria erschweren. Mittlerweile wurden P. falciparum Stämme mit pfhrp2-Gendeletionen in allen Malariaregionen weltweit nachgewiesen. Der Nachweis wird mittels konventioneller PCR auf den pfhrp2-Genlocus geführt. In vielen Endemiegebieten in Afrika gibt es jedoch bis jetzt kaum gut erhobene Daten über den pfhrp2-Status der dortigen Parasitenpopulation. Im Rahmen dieser Arbeit wurde erstmals eine Multiplex-qPCR zur Detektion von Deletionen etabliert. Mit dieser Methode können zeiteffizient große Stichproben untersucht werden. Mit dem neuen 4plex-qPCR-Protokoll konnten neben pfhrp2 und pfhrp3, die wichtig für die RDT-Diagnostik sind, parallel pf β-tublin und pf cytochrom b detektiert werden. Pf β-tublin ist wie pfhrp2 ein „single copy gene“ und dient hier entsprechend als Kontrollgen. Das Protein von pfhrp3 reagiert durch seine Ähnlichkeit zu PfHRP2 ebenfalls in RDTs und auch Deletionen dieses Gens wurden beobachtet. Deshalb soll auch dieses Gen parallel amplifiziert werden. Pf cytochrom b dient dem Nachweis einer P. falciparum Infektion. Das Detektionslimit liegt für pfhrp2 und pfhrp3 bei 204 Parasiten/ml Blut, für pf β-tublin bei 600 Parasiten/ml und für pfcytb bei 60 Parasiten/ml. Im Vergleich zu anderen diagnostischen Methoden (Mikroskopie und RDT) wurde damit eine viel höhere Sensitivität erreicht. Das etablierte Protokoll wurde an zwei qPCR-Geräten getestet und funktioniert sowohl am Rotor-Gene 3000 als auch am LightCycler 480 II. Das 4plex-qPCR-Protokoll muss nun mit Proben aus einem Patientenkollektiv von Infizierten und Uninfizierten weiter validiert werden, bevor es im Rahmen von epidemiologischen Studien in Afrika eingesetzt werden wird.