Über Stringent response, Aminosäure Metabolismus und essentielle Aminosäuren in Staphylococcus aureus

Abstract

Staphylococcus aureus ist einer der bedeutendsten Verursacher nosokomialer Infektionen und kann ein breites Spektrum verschiedener Erkrankungen auslösen. Das Bakerium kann unter verschiedensten Umweltbedingungen mit einer breiten Ressourcenvariabilität überleben. Dafür hat es eine Vielzahl von regulativen Mechanismen zur Verfügung. Die sogenannte „Stringente Antwort“ ist wesentlich für die metabolische Anpassung insbesondere hinsichtlich des Aminosäuremetabolismus. Sie erlaubt die Expression von Biosynthese-Geneclustern und wird durch Aminosäuremangel mittels der (p)ppGpp Synthetase RSH aktiviert. Die führt zur Verringerung der intrazellulären GTP-Konzentration und nachfolgend zur De- Reprimierung des Transkriptionsfaktors CodY. CodY reprimiert unter nicht limitierenden Bedingugnen viele Aminosäure-Biosynthese-Gene. CcpA ist ein weiterer zentraler metabolischer Regulator, welcher ebenfalls einen Effekt auf die Expression metabolischer Gencluster zeigt. Die Genomsequenzen von S. aureus Isolaten sind gut annotiert und die RSH, CodY und CcpA abhängigen Regulons publiziert. Daneben gibt es eine Vielzahl von Publikationen, die Aufschluss über einzelne metabolische Mechanism der Aminosäure-Synthese erlauben. Ziel dieser Arbeit war es auf Grund dieser Erkenntnisse einen integrierten Einblick hinsichtlich des metabolischen Netzwerks von S. aureus zu erlangen. Hierzu wurde eine in silico Analyse gewählt bei der die Interaktion der zentralen Knoten CodY, RSH und CcpA in einem semiquantitativen Booleansches Netzwerk (195 Knoten und 320 Kannten) der „Stringenten Antwort“ und des Aminosäure Metabolismus dargestellt wurden. Jeder Knoten repräsentiert die Aktivität einer logischen Einheit also z.B. eines Gens aber auch seiner Produkte (mRNA und Proteine). Von mir entwickelte Logikgatter erlauben es AND-Bedingungen korret darzustellen. Anhand von in-vitro Wachstumsxperimenten von knockout Mutanten in Aminosäure Mangelmedien wurde das aus Literaturdaten erstellte Netzwerk getestet und validiert. Es zeigte sich semiquantitativ eine sehr gute in-vitro - in-silico Übereinstimmung von durchschnittlich 62%. Durch Postulieren und Überprüfen zusätzliche Kanten wurde eine Übereinstimmung von 81% erreicht. Diese Kanten stellen in silico erfolgreiche Erklärungen von in-vitro Phenomenen dar und müssen in weiteren Experimenten validiert werden. Einige S.aureus-Stämme zeigen Wachstum erst nach 24h, bei erneuter Anzucht derselben Probe jedoch von Anfang an. Dies legt einen Anpassungsprozess nahe der innerhalb der 24h des Experimentes stattgefunden haben muss. Ob diese Anpassung genetisch oder regulatorisch vermittelt ist müssen weitere Experimenr zeigen. Das hier vorgestellte, validierte und getestete Netzwerk zeigt zusammen mit den Wachstumskurven neben den essentiellen Aminosäuren der verschiedenen Stämme die Bedeutung der zentralen Knoten CodY, RSH und CcpA, vor allem in der Feinregulation von Stringent Response und Aminosäure Metabolismus in S. aureus. Das Netzwerk stellt ein gut passendes theoretisches Modell der Signalkaskaden dar, es liefert Vorhersagen über Mutationen für jeden Knoten im Netzwerk und bietet damit die Möglichkeit zur schnellen und kostengünstigen Analyse. So erlaubt es ein besseres Verständnis metabolischer Anpassungsstrategien sowie essentieller Aminosäuren von S.aureus.