Funktionsanalyse von GFP- und DsRed-Prestin-Isoform-Fusionsproteinen an transfizierten HEK293A-Zellen mittels patch-clamp, Fluoreszenzmikroskopie und Rasterkraftmikroskopie

Abstract

Schwerhörigkeit ist eine weit verbreitete sensorische Erkrankung beim Menschen. Die congenitale Schwerhörigkeit ist häufig erblich verursacht und besteht sehr oft in einer Innenohrschwerhörigkeit. Das genaue Verständnis der Innenohrfunktion und dadurch initiierter Entwicklungsprozesse für neue Therapieansätze gehört zu den zentralen Interessen der Hörforschung. Prestin ist ein Motorprotein, welches in der Zellmembran der äußeren Haarzellen der Cochlea lokalisiert ist. Dieses Protein ist für die motilen Zellantworten der äußeren Haarzellen verantwortlich, welche die molekulare Basis des aktiven cochleären Verstärkers bilden. Der aktive cochleäre Verstärkungsmechanismus ist für die hohe Frequenzselektivität des Innenohres und damit z.B. für das Sprachdiskriminierungsvermögen des Menschen verantwortlich. Prestin führt über die Transformation von elektrischen Potentialänderungen in Konformationsänderungen zu Längenänderungen der äußeren Haarzellen. Der Ausfall der Funktion von Prestinproteinen durch z.B. Genmutationen wurde kürzlich mit einer schwerwiegenden Form von nicht-syndromaler, hereditärer Innenohrschwerhörigkeit in Zusammenhang gebracht. Bisher ist die Funktion einer trunkierten Prestinisoform der Ratte (Prestin9b), die homolog zu einer Isoform im menschlichen Innenohr ist, sowie putativer Prestininteraktionspartner Rab10 (1) und Calmodulin (2) unbekannt. In der vorliegenden Studie wurde ein in vitro Zellsystem zur Solo- und Kotransfektion von Prestin, sowie von Prestin9b, Rab10 und Calmodulin in HEK293A-Zellen etabliert. Es wurde darüber hinaus ein System zur Messung funktioneller Veränderungen von mit FL-Prestin transfizierten HEK-Zellen anhand der Zellmembranauslenkung bei Zellmembranpotentialänderung mittels whole-cell patch-clamp-Technik und der Rasterkraftmikroskopie aufgebaut. Der Transport der translatierten Proteine in die Zellmembran konnte für FL-Prestin, rPrestin9b und Calmodulin in Solotransfektion, sowie für FL-Prestin und Calmodulin und vereinzelt für FL-Prestin und rPrestin9b in Kotransfektion nachgewiesen werden. Mit FL-Prestin transfizierte HEK-Zellen zeigten eine bis zu 10fach höhere Zellmembranauslenkung als untransfizierte. Damit konnte in der vorliegenden Studie die Basis für eine weiterführende Funktionsanalyse von rPrestin9b sowie putativer Prestininteraktionpartner gelegt werden. Mithilfe der in der vorliegenden Studie etablierten Funktionsanalysen von Prestin und seiner putativen Interaktionspartner konnte somit die funktionelle Interaktion von transfizierten Genkonstrukten des Prestinproteins direkt gemessen werden. Ein erweiterer Einblick in die molekulare Funktionsweise des aktiven cochleären Verstärkers wurde vorbereitet.