Mechanismen des durch Enterokokken induzierten Zelltodes in Makrophagen

Abstract

Durch den Einsatz von Antibiotika haben sich sowohl Virulenz als auch Re-sistenz der den Darm besiedelnden Enterokokken erhöht und sukzessive zu einem gravierenden Anstieg der Infektionsraten geführt. Aktuelle Daten der ECDC zeigen für Vancomycin-resistente E. faecium-Blutkulturisolate einen Anstieg von 9,1% im Jahr 2014 auf 16,5% im Jahr 2017 (ECDC-EARS-Net, 2019). Untersuchungen zur Pathogenese und zu Mechanismen von Infektionen durch E. faecium sind daher von hoher klinischer Relevanz. In der hier vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob es sich bei durch E. faecium induziertem Zelltod von Makrophagen um einen programmierten Zelltod in Form der Apoptose oder um einen toxisch bedingten Zelluntergang in Form von Nekrose handelt. Als Targetzellen für die Infektionsversuche mit E. faecium (ATCC 6057) dienten J774A.1-Makrophagen. Es konnte nachgewiesen werden, dass Zelltodinduktion nicht durch Überstände, sondern durch Pellets von E. faecium, also zelluläre bakterielle Bestandteile verursacht werden. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die Zugabe von Lysozym essentiell für die Induktion des Zelltods durch E. faecium ist. Bei der elektronenmikroskopischen Untersuchung von J774A.1-Makrophagen nach Infektion mit E. faecium und Zugabe von Lysozym waren typische morphologische Zeichen nekrotischen Zelltods mit Vakuolisierung des Zyto-plasmas und Zellschwellung zu beobachten. Apoptotische Merkmale wie Kernfragmentierung oder Zellschrumpfung waren dagegen nicht nachweisbar. Fehlende Schrumpfung bei durch E. faecium infizierten Makrophagen und ein extrazellulärer Nachweis von LDH infolge Ausstroms aus den Zellen durch Nekrose bedingte, poröse Zellwände sind weitere Zeichen für nekrotischen Zelltod und wurden in der vorliegenden Arbeit nachgewiesen. Als weitere Methode zur Differenzierung des Zelltods von E. faecium infizierten Makrophagen wurde in der vorliegenden Arbeit ein Immunoblotting für Caspase 3 durchgeführt. In dieser Untersuchung konnte gezeigt werden, dass bis 4 h nach Versuchsbeginn und bei Zugabe von Staurosporin die aktiven Caspase-3-Formen p17 und p19 im Immunoblotting vorhanden waren, woraus auf durch Staurosporin induzierte Apoptose geschlossen werden konnte. Dagegen war die Spaltung von Procaspase 3 in die aktiven Formen p17 und p19 im Immunoblotting von mit E. faecium infizierten J774A.1-Makrophagen 2 und 4 Stunden nach Versuchsbeginn nicht nachweisbar. Damit konnte ein¬deutig auf einen Zelltod durch Nekrose geschlossen werden. In einer In-vivo-Untersuchung wurden die Ergebnisse der In-vitro-Unter-suchungen hinsichtlich eines nekrotischen bzw. apoptotischen Zelltods nach Infektion von peritonealen Makrophagen mit E. faecium überprüft und bestätigt. Messungen des transmembranen Potentials und der Propidiumiodid-Positivität von peritonealen Makrophagen zeigten erst bei zusätzlicher Gabe von Lysozym eine signifikant höhere Zelltodrate durch Nekrose in der Tiergruppe nach Infektion mit E. faecium.