Investigating the role of cGMP-dependent protein kinase I in thermogenesis in mice

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde die Bedeutung der cGMP-abhängigen Proteinkinase I (cGKI) für die durch Kältestress induzierte Thermogenese in Mäusen untersucht. Genetisch veränderte Mäuse, denen die cGKI im Nervensystem fehlt (cGKI-Hirn KO Mäuse), wurden mit Hilfe der Cre/lox Technologie durch Verwendung von Nestin-Cre Mäusen erzeugt. Die Versuchstiere wurden einer Kältebelastung unterzogen und hinsichtlich verschiedener Parameter untersucht. Gemessen wurde u.a. ihre Körpertemperatur mittels rektaler Sonde, der Noradrenalin-Gehalt im braunen Fettgewebe („brown adipose tissue“, BAT) mittels Immuntest, der Gehalt an Proteinen, die mit der Thermogenese assoziiert sind, durch Western Blot, sowie die Aktivität des BAT durch Positronen-Emissions-Tomographie (PET) mit radioaktiv markierter Glukose ([18F]FDG). Des Weiteren wurden cGMP-Messungen mit einem Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET)-basierten cGMP-Sensorprotein und zahlreiche Analysen des BAT mittels Immunfärbungen durchgeführt. Wir haben die Expression von cGKI in verschiedenen Regionen des Hypothalamus sowie in neuronalen und nicht-neuronalen Zellen des BAT nachgewiesen, nicht aber in den braunen Fettzellen selbst. cGKI-Hirn KO Mäuse zeigten eine beeinträchtigte Regulation der Körpertemperatur während akutem Kältestress. Die Noradrenalin-Konzentration war im BAT von cGKI Mutanten unter basalen Bedingungen signifikant reduziert und nach Kälteexposition tendenziell geringer als bei Kontrolltieren. Der Gehalt an Tyrosinhydroxylase und „Uncoupling Protein 1“ war im BAT aller Versuchsgruppen ähnlich, sowohl vor als auch nach Kälteexposition. Die PET-Analyse wies darauf hin, dass die BAT Aktivität von cGKI-Hirn KO Mäusen unter Kältestress signifikant geringer war als von Kontrolltieren. FRET-basierte cGMP-Messungen in Gewebelebendschnitten zeigten, dass bestimmte cGKI-positive Zellen im BAT durch NO zur cGMP-Synthese angeregt werden können. Diesen bisher noch nicht beschriebenen cGKI-positiven Zelltyp haben wir nicht nur im BAT, sondern auch in der Nebennierenrinde entdeckt und mittels Immunfärbung mit Markerproteinen als Perizyten, die mit kleinen Blutgefäßen assoziiert sind, identifiziert. In dieser Arbeit haben wir eine wichtige Rolle von cGMP und der cGKI für die kälteinduzierte Thermogenese im BAT von Mäusen nachgewiesen. Unsere Ergebnisse weisen darauf hin, dass die cGKI nicht direkt in den braunen Fettzellen exprimiert wird, sondern die BAT-Aktivität indirekt reguliert, z.B. über die Noradrenalin-Ausschüttung von Neuronen und/oder über Perizyten an Kapillaren, die möglicherweise den Blutfluss im BAT beeinflussen.

This project investigated the role of cGMP-dependent protein kinase I (cGKI) in cold-stress-induced thermogenesis in mice. A genetic mouse model lacking cGKI in the nervous system (cGKI-brain KO mice) was generated via Cre/lox technology using the Nestin-Cre mouse line. After exposure of experimental animals to cold-stress, multiple parameters were analysed. We measured body temperature with a rectal probe, noradrenaline content in brown adipose tissue (BAT) by immunoassay, thermogenesis-related proteins by Western blot, and BAT activity via positron emission tomography (PET) with radio-labelled glucose ([18F]FDG). cGMP was monitored using a fluorescent resonance energy transfer (FRET)-based cGMP sensor protein, and numerous other BAT analyses were performed by immunostaining. We have demonstrated the expression of cGKI in different regions of the hypothalamus as well as in neuronal and non-neuronal cells of BAT, but not in brown adipocytes themselves. cGKI-brain KO mice showed impaired regulation of body temperature during acute cold-stress. Noradrenaline concentration was significantly lower in BAT of cGKI mutant mice under basal conditions and tended to be lower after cold exposure than in control animals. The levels of tyrosine hydroxylase and uncoupling protein 1 were similar in BAT of all experimental groups, both before and after cold exposure. PET analysis indicated that BAT activity of cGKI-brain KO mice under cold-stress was significantly lower than that of control animals. FRET-based cGMP measurements in live tissue sections showed that certain cGKI-positive cells in BAT can be stimulated by NO to generate cGMP. We discovered this previously unknown cGKI-positive cell type not only in BAT, but also in the adrenal cortex, and identified it by immunostaining with marker proteins as pericytes associated with small blood vessels. In sum, we have demonstrated an important role of cGMP and cGKI in cold-induced thermogenesis in BAT of mice. Our results indicate that cGKI is not directly expressed in brown fat cells, but instead indirectly regulates BAT activity, e.g. via noradrenaline release from neurons and/or via pericytes around capillaries, which may influence blood flow in BAT.