Signal transduction involving GSK3 and activation of CASR by magnesium during medial vascular calcification

Abstract

Mediale Gefäßverkalkung, die Ablagerung von Kalzium-Phosphat in den medialen Schichten der Arterien, wird als ein aktiver und hochgradig regulierter Prozess angesehen. Dieser wird wahrscheinlich durch osteo-/chondrogene Transdifferenzierung von glatten Gefäßmuskelzellen kontrolliert. Bislang sind die zugrundeliegenden Signalwege nicht genau bekannt. Die Gefäßverkalkung ist stark assoziiert mit kardiovaskulärer Mortalität, aufgrund des fehlenden Wissens über die zugrundeliegenden Signalwege gibt es bislang keine therapeutische Behandlung. Diese Arbeit untersuchte daher neue Signalwege der Verkalkung von Gefäßmuskelzellen Eine mögliche Behandlungsstrategie könnte Magnesiumsupplementation darstellen, welche die Gefäßverkalkung hemmen könnte. Es wurden daher Signalwege der protektiven Wirkung von Magnesium untersucht. Die Phosphat-induzierte Verkalkung und mRNA Expression der osteogenen Marker core-binding factor α1, msh homeobox 2, und tissue-nonspecific alkaline phosphatase wurde durch Magnesium abgeschwächt. Magnesium erhöhte die mRNA Expression des calcium-sensing recptors in humanen Gefäßmuskelzellen. Der Effekt von Magnesium auf die phosphat-induzierte Verkalkung und Expression der osteogenen Marker wurden durch den calcium-sensing receptor Agonisten Gadolinium repliziert. Silencing des calcium-sensing receptors oder der Antagonist NPS-2143 blockierten die anti-kalzifizierende Wirkung von Magnesium. Cholecalciferol-Überladung in Mäusen induzierte in Gefäßen Verkalkung und vermehrte mRNA Expression der osteogenen Marker core-binding factor α1, msh homeobox 2, tissue-nonspecific alkaline phosphatase, sowie collagen type I, collagen type III und fibronectin. Diese Effekte wurden durch Magnesium abgeschwächt. Weitere Versuche untersuchten eine Beteiligung der Glycogen synthase kinase 3 (GSK-3) während vaskulärer Verkalkung. Die Verkalkung und Erhöhung der osteogenen Marker msh homeobox 2, core-binding factor α 1 und tissue-nonspecific alkaline phosphatase, sowie mRNA Expression des type III sodium-dependent phosphate transporter und plasminogen activator inhibitor 1 nach Cholecalciferol-Überladung waren abgeschwächt in Gsk-3α/β Doppel-knock-in Mäusen, in denen eine GSK3 Phosphorylierungsstelle für AKT/SGK fehlt. Ebenso war die Verkalkung und Expression der osteogenen Marker in Phosphat-exponierten Gefäßringen von GSK3-knock-in Mäusen abgeschwächt. Diese Beobachtungen liefern damit neue Erkenntnisse über die Signalwege der Verkalkung von glatten Gefäßmuskelzellen. Die anti-kalzifizierenden Effekte von Magnesium wurden zumindest zum Teil durch den calcium-sensing receptor vermittelt. Ebenso ist die GSK3 anscheinend in die Signalwege der Gefäßverkalkung involviert. Diese Ergebnisse erweitern das Wissen um die Mechanismen der Gefäßverkalkung, das ultimativ dazu beitragen könnte, eine therapeutische Strategie zur Verhinderung der Verkalkung zu entwickeln

Medial vascular calcification, the deposition of calcium-phosphate in the media of the vasculature, is considered as an active and highly regulated process. This is believed to be controlled by osteo/chondrogenic transformation of vascular smooth muscle cells. Until now, the underlying mechanisms are incompletely understood. The calcification of arterial tissue is closely associated with cardiovascular mortality, but due to the incomplete understanding about the mechanisms of vascular calcification, no therapeutic treatment exists. This work studied new signaling pathways in vascular smooth muscle cell calcification. A putative therapeutic strategy may be magnesium supplementation, which counteracts vascular calcification. Therefore, possible signaling pathways to mediate the effects of magnesium were investigated in vascular smooth muscle cells. The phosphate-induced calcification and the mRNA expression of the osteogenic markers core-binding factor α1, msh homeobox 2, and tissue-nonspecific alkaline phosphatase in human aortic smooth muscle cells were ameliorated by additional treatment with magnesium. The presence of magnesium chloride enhanced mRNA expression of the calcium-sensing receptor in human aortic smooth muscle cells. Most importantly, the blunting effects of magnesium on calcification and osteogenic markers mRNA expression were reproduced by the calcium-sensing receptors activator gadolinium. Furthermore, the anti-calcific effects of Magnesium were abolished by silencing of the calcium-sensing receptor or addition of its antagonist NPS-2143. Furthermore, cholecalciferol overload in mice led to vascular calcification and upregulated aortic osteogenic markers core-binding factor α1, msh homeobox 2, tissue-nonspecific alkaline phosphatase and collagen type I, collagen type III and fibronectin mRNA expression in mice. These effects were ameliorated by supplementary treatment with magnesium chloride. Further studies investigated a contribution of the Glycogen synthase kinase 3 (GSK-3) during vascular calcification. The calcification and upregulated expression of osteogenic markers msh homeobox 2, core-binding factor α1 and tissue-nonspecific alkaline phosphatase as well as mRNA expression of type III sodium-dependent phosphate transporter and plasminogen activator inhibitor 1 following cholecalciferol overload in mice was blunted in Gsk-3α/β double knock-in mice, which lack the functional AKT/SGK phosphorylation sites. In addition, phosphate exposure induced calcification and osteogenic markers expression in aortic ring explants from GSK-3 wild type mice, effects blunted in aortic ring explants from GSK-3 knock-in mice. The current observations thus shed new light on the signaling pathways of vascular smooth muscle cell calcification. The anti-calcific effects of magnesium are at least in part mediated via the calcium-sensing receptor. Furthermore, the GSK3 is apparently involved in the pro-calcifying signaling cascades. These observations extend the current knowledge on the mechanisms of calcification, an understanding that may ultimately lead to development of a therapeutic approach.