A novel treatment strategy for colorectal cancer: Measles vaccine virus-induced oncolysis in combination with immune checkpoint inhibitors and NK cells / peripheral blood mononuclear cells

Abstract

In der jüngsten Vergangenheit der Virotherapie wurde die spezielle Eigenschaft der virusinduzierten Onkolyse, einen immunogenen Stimulus gegen bösartige Zellen zu triggern, ausgenutzt, um mit neuen immunovirotherapeutischen Kombinationsansätzen vorbestehende Tumor-Resistenzen zu überwinden. Ziel dieser Dissertationsschrift war es, einen solchen neuen multimodalen Therapieansatz für das kolorektale Karzinom (CRC) zu untersuchen. In einem in vitro Modell humaner kolorektaler Karzinomzelllinien aus dem NCI-60 Tumorzellverzeichnis wurde getestet, ob Immun-Checkpoint-Inhibitoren (ICI) einen solchen therapeutischen Zusatznutzen erbringen können, wenn sie mit onkolytischen Masernimpfviren, welche grün fluoreszierendes Protein exprimieren (MeV-GFP), und mit NK Zellen oder peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) kombiniert werden. Um vorbestehende Resistenzen der jeweiligen Monotherapien in den unterschiedlichen Tumorzelllinien zu testen, wurden zunächst Sulforhodamine B (SRB) Zytotoxizitätsassays durchgeführt. In zwei humanen kolorektalen Karzinomzelllinien, HT29 (suszeptibel gegenüber Masern-induzierter Onkolyse) und SW-620 (intermediär resistent gegenüber Masern-induzierter Onkolyse), konnte eine Infektion mit MeV-GFP eine konzentrations- und zeitabhängige Tumorzellmassenreduktion erreichen, wohingegen sich HCT-15 Tumorzellen als hoch resistent gegenüber MeV-GFP-induzierter Onkolyse erwiesen. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die Monotherapie von HT29 und HCT-15 mit Nivolumab (gerichtet gegen PD-1) oder Atezolizumab (gerichtet gegen PD-L1) die Tumorzellviabilität in Abwesenheit von Immunzellen nicht reduziert. In einem weiteren Schritt wurden FACS Messungen der PD-L1 Expression auf den genannten Darmkrebszelllinien durchgeführt, um zunächst die basale Expression dieses Immuncheckpoint-Liganden zu beurteilen, woraufhin die Tumorzellen mit Masern infiziert wurden und in einem zweiten Schritt der Einfluss einer Infektion auf die PD-L1 Expression untersucht wurde. Ausgehend von unterschiedlichen basalen PD-L1 Expressionsraten konnte eine Infektion sowohl mit MeV-GFP als auch mit MeV-SCD, einem Suizidgen-verstärkten Masernvirotherapeutikum, das für eine Supercytosin Deaminase (SCD) kodiert, die PD-L1 Expression in allen drei huamanen Darmkrebszelllinien steigern. Bezüglich der Infektion mit MeV-SCD stieg die Expression in allen drei getesteten Darmkrebszelllinien mit der Viruskonzentration und in zwei von drei getesteten Tumorzelllinien auch mit der Kultivierungszeit nach der Infektion. Zudem wurden auch die Expressionsraten des Immuncheckpoint-Rezeptors PD-1 auf CD56 positiven NK Zell-Populationen von vier unterschiedlichen, gesunden Spendern untersucht, wobei sich weniger als 1 % PD-1 positive Zellen ergaben. Dieses Ergebnis kann bewertet werden als eine ausgangsmäßig schlechte Voraussetzung dafür, an einer direkten PD-1 / PD-L1 Interaktion teilzunehmen. In einer Echtzeitmessung von Tumorzellwachstum und -viabilität im xCELLigence Assay wurde in einem weiteren Schritt unter Einfluss von unserer Kombinationstherapie und von Immunzellkokultur auf eine erhöhte Anti-Tumor-Effektivität getestet. Dabei konnte bereits durch die Kombination von Immunzellkokultur mit Maserninfektion ein gesteigerter therapeutischer Effekt im Vergleich zu beiden Monotherapien gezeigt werden, der sich jedoch leider durch zusätzliche Behandlung mit ICI (Nivolumab und / oder Atezolizumab) nicht weiter steigern ließ. Schließlich wurden antivirale Effekte einer Immuncheckpointblockade untersucht: Weder in einem Viruswachstumskurvenmodell, noch bei Virustitrierungen nach Immunzellkoinkubation konnte eine Beeinflussung der Replikation und Ausbreitung von MeV-GFP in CRC Zelllinien durch ICI gefunden werden. Zusammenfassend kann man davon ausgehen, dass die Hochregulierung von PD-L1 auf humanen Darmkrebszellen durch eine Infektion mit MeV einem vielversprechenden therapeutischen Ansatz entspricht, um ICI und Masern-basierte Virotherapie zu kombinieren. Allerdings konnten in vitro xCELLigence Analysen unter Immunzellkokultur zunächst keinen therapeutischen Zugewinn durch unseren immunovirotherapeutischen Ansatz erkennen lassen. In Anbetracht der limitierten Möglichkeiten eines in vitro Modells des komplexen menschlichen Immunsystems sollte unser therapeutisches Regime allerdings dennoch in einem immunkompetenten Darmkrebs-Mausmodell und besser noch im Rahmen früher klinischer Studien (Phase I/II) genauer untersucht werden.

In the recent past of virotherapy, the characteristic trait of virus-induced oncolysis to trigger an immunogenic stimulus against malignant cells was utilized for new immunovirotherapeutic combination approaches, thereby overcoming preexisting resistances. Aim of this dissertation thesis was to investigate such a novel multimodal therapeutic strategy for treatment of colorectal carcinoma (CRC). In an in vitro model of human CRC cell lines from the NCI-60 tumor cell panel, it was tested whether immune checkpoint inhibitors (ICI) could achieve a therapeutic gain, combined with an oncolytic measles vaccine virus expressing green fluorescent protein (MeV-GFP) and with NK cells or peripheral blood mononuclear cells (PBMC). Sulforhodamine B (SRB) cytotoxicity assays were performed to uncover preexisting resistances of the respective monotherapies in the different tumor cell lines. In two human CRC cell lines, HT29 (susceptible to measles-induced oncolysis) and SW-620 (exhibiting an intermediate resistance to measles-induced oncolysis), infection with MeV-GFP achieved a multiplicity of infection (MOI)- and time-dependent reduction of tumor cell mass, whereas HCT-15 tumor cells were observed to be highly resistant to MeV-GFP-induced oncolysis. Moreover, monotherapeutic treatment of HT29 and HCT-15 with nivolumab (targeting PD-1) or atezolizumab (targeting PD-L1) did not reduce tumor cell viability in the absence of immune cells. FACS analysis of PD-L1 expression on CRC cell lines was conducted to firstly estimate the basal expression of this immune checkpoint ligand, whereupon tumor cells were measles-infected and, in a second step, the influence of infection on PD-L1 expression was investigated. Showing different degrees of basal PD-L1 expression, infection with both MeV-GFP and MeV-SCD, a suicide gene-enhanced measles virotherapeutic coding for Super-cytosine deaminase (SCD), increased PD-L1 expression in all three human CRC cell lines. In terms of MeV-SCD-infection, expression of PD-L1 further rose with augmentation of MOI for all three tested CRC cell lines and also with time of culture after infection for two out of three tested tumor cell lines. Furthermore, expression rates of the immune checkpoint receptor PD-1 on CD56 positive NK cell populations from four different healthy donors were investigated, resulting in less than 1 % of PD-1 positive cells. This result can be assessed as a poor precondition to take place in a direct PD-1 / PD-L1 interaction. In a next step, we tested for augmented anti-tumor efficacy under the influence of our combination treatment and immune cell coculture, using the real-time tumor cell growth and viability xCELLigence analysis. Thereby, the combination of immune cell coculture with measles infection could already show increased therapeutic effects in comparison to the respective monotreatments, albeit unfortunately, this effect could not be further strengthened by additional application of ICI (nivolumab and / or atezolizumab). Finally, antiviral effects of immune checkpoint blockade were examined: Neither in a viral growth curve model, nor in viral titrations after immune cell coincubation, an influence of ICI on replication and spread of MeV-GFP in CRC cell lines could be found. To summarize, the upregulation of PD-L1 on human CRC cells via MeV-infection correlates with a promising therapeutic setting for combining ICI with measles-based virotherapy. However, in vitro xCELLigence analysis under immune cell coculture could not reveal a therapeutic gain of our immunovirotherapeutic approach. Nonetheless, considering the limited possibilities of an in vitro model of the complex human immune system, our therapeutic regimen should be further investigated in an immunocompetent mouse model of CRC and, even more, in the context of early clinical trials (i.e. phase I/II studies).