Translational control of a set of mRNAs by RNA-binding protein Bfr1p at the ER in budding yeast

Abstract

Die translationale Regulation von mRNA ist ein wichtiger Mechanismus, durch den Zellen die Proteinsynthese modulieren. Die mRNAs, die für sekretierte Proteine oder Proteine des Endomembransystems kodieren, werden am endoplasmatischen Retikulum (ER) translatiert. In Saccharomyces cerevisiae wurde das Brefeldin A Resistenzfaktor 1 Protein (Bfr1p) erstmals als Mehrfachkopiesuppressor von Brefeldin A identifiziert und eine Funktion im Sekretionsweg vorgeschlagen. Obwohl BFR1 ein nicht essentielles Gen ist, zeigen die bfr1Δ Zellen verschiedene Phänotypen, beispielsweise eine veränderte Zellform und Zellgröße, Änderung der Ploidie, Induktion von P-bodies und Chromosomenfehlsegregation. Spätere Studien haben jedoch gezeigt, dass Bfr1p als Bestandteil von Polysomen an verschiedene mRNAs im ER bindet und die Mehrheit dieser mRNAs für Sekretions- oder Endomembranproteine kodiert. Obwohl Bfr1p keine kanonischen RNA-Bindungsdomänen aufweist, ergab eine UV-crosslink, das die RNA in vivo über sechs Aminosäurereste. Diese Studien legen nahe, dass Bfr1p eine potenzielle Rolle bei der Translationskontrolle von mRNAs spielt. Die molekulare Funktion von Bfr1 ist bis heute nicht bekannt. In dieser vorliegenden Studie zeige ich, dass die Bfr1p Lokalisierung zum ER RNA-abhängig ist und eine Punktmutation F239 von Bfr1p ausreicht, um diese Lokalisierung zu beeinflussen. Außerdem zeige ich, dass die Rolle von Bfr1p bei der Aufrechterhaltung der Ploidie, der Induktion von P-bodies und der Brefeldin A-Resistenz von seinen RNA Wechselwirkungen unabhängig ist. In Übereinstimmung mit den vorherigen Studien zeigte sich, dass Bfr1p an die ERG4 mRNA bindet, die für ein Enzym kodiert, das im letzten Schritt der Ergosterol-Biosynthese beteiligt ist, und dass die RNA-bindenden Mutanten diese Bindung beeinflussen. Obwohl ERG4 mRNA in bfr1Δ Zellen im ER lokalisiert ist, ist der Gehalt an Erg4p möglicherweise aufgrund der Fehlfaltung und dem Abbau über den ERAD Weg im Zytoplasmastask verringest. Mit den Experimenten zur Ribosomenaffinitätsreinigung (RAP) und Polysomenprofilierung konnte eine Verringerung der gesamten ribosomalen Belegung der ERG4 mRNA in bfr1Δ Zellen und ein erhöhtes Verhältnis von Monosomen zu Polysomen in RNA-bindenden Mutanten von Bfr1p nachgewiesen warden. Dies deutet auf eine Rolle von Bfr1p in der Translationselongation hin/oder korrekte Protein Translokation die am ER werden. Zusammengefasst liefert diese Studie weitere Beweise für die oben erwähnten Rolle von Bfr1p bei der Translationskontrolle, wobei Bfr1 ebenfalls einen Einfluss auf die Flufrechterhaltung der Ploidie hat.

Translational regulation of mRNA is an important mechanism by which cells modulate protein synthesis. The mRNAs that encode for secreted proteins or proteins of the endomembrane system are translated at the endoplasmic reticulum (ER). In Saccharomyces cerevisiae, Brefeldin A resistance factor 1 protein (Bfr1p) was first identified as a multi-copy suppressor of Brefeldin A and proposed to have a function in the secretory pathway. Although BFR1 is a non-essential gene, bfr1Δ cells show several defects, including altered cell shape and size, change in ploidy, induction of P-bodies and chromosomal mis-segregation. However, later studies have shown Bfr1p as a component of polysomes, binding to several hundred mRNAs at the ER and most of these mRNAs encode for secretion or endomembrane proteins. Despite Bfr1p lacking canonical RNA-binding domains, an in vivo UV-crosslink of Bfr1p with RNA revealed six residues in Bfr1p that are cross-linked with the RNAs. These studies suggest a potential role of Bfr1p in translational control of mRNAs, however its molecular function remains elusive to date. In this present study, I show that the Bfr1p’s localization to the ER is RNA-dependent and that a point mutation in the RNA-binding residue F239 of Bfr1p alone is enough to affect this localization. Further, I show that the roles of Bfr1p in ploidy maintenance, P-bodies induction and brefeldin A resistance are independent of its interaction with RNA. Consistent with the previous studies, I show that Bfr1p binds to ERG4 mRNA, which encodes an enzyme involved in the final step of ergosterol biosynthesis and that the RNA-binding mutants of Bfr1p impede this binding. Although ERG4 mRNA localizes to the ER in bfr1Δ cells, the levels of Erg4 protein is strongly reduced, possibly due to its misfolding and subsequent re-translocation to the cytoplasm for degradation via the ERAD pathway. Using ribosome affinity purification (RAP) and polysome profiling, I demonstrate a reduction in the total ribosomal occupancy on the ERG4 mRNA in bfr1Δ cells and an increased ratio of monosomes to polysome in RNA-binding mutants of Bfr1p, suggesting a role for Bfr1p in translational elongation or protein translocation of the mRNAs that are translating at the ER. Taken together, this study provides further evidence of the proposed role of Bfr1p in translational control with separation from its function in ploidy maintenance.