Inhibition of the Hedgehog pathway in combination with cytostatics as potential therapeutic option in Ewing Sarcoma

Abstract

Ewing Sarkome (EWS) zählen zu den mesenchymalen Tumoren und treten gehäuft bei Kindern und Jugendlichen auf. Patienten mit nicht-metastasiertem EWS, die sich einer radikalen chirurgischen Intervention, Radiotherapie und/oder Chemotherapie unterziehen, zeigen eine durchschnittliche 5-Jahres Überlebensrate von über 70 %, wohingegen metastasierte und rezidivierte EWS deutlich schwerer zu behandeln sind. Einer der vielen Gründe dafür ist die zunehmende Resistenz von rezidivierten EWS gegen Chemotherapeutika. Diese beruht unter anderem darauf, dass ABC Transporter wie PGP oder MRP1, welche die Chemotherapeutika wieder aus der Tumorzelle in den Extrazellularraum befördern, von diesen exprimiert werden. Darüber hinaus wird vom EWS das für den Tumor charakteristische Fusionsprotein EWS-FLI1 exprimiert, welches auch die GLI Proteine im Hedgehog (Hh) Signalweg moduliert. Veränderungen im Hh Signalweg wurden bereits in verschiedenen Tumoren beobachtet und korrelieren mit einer erhöhten Tumorbildung und Progression. Da der Hh Signalweg direkt die Expression von ABC Transportern beeinflusst, wurde in dieser Arbeit die Inhibition der GLI Proteine als mögliche zusätzliche Therapieoption zur Unterdrückung der Chemoresistenz getestet. Dafür wurden drei EWS Zelllinien mit den GLI Inhibitoren GANT61 und ATO, sowie den bereits etablierten Chemotherapeutika Etoposid und Doxorubicin behandelt und ihre Viabilität, Koloniebildungsfähigkeit, Wachstum in 3D Kulturen und Induktion von Zelltod mittels MTS Assay, Koloniebildungs-Assay, 3D Spheroid Assay, Durchflusszytometrie und Western Blot getestet. ATO, Etoposid und Doxorubicin reduzierten die Viabilität signifikant und selektiv in allen drei EWS Zelllinien im Vergleich zu mesenchymalen Stammzellen (MSC). Dahingegen war GANT61 weniger effizient in zwei der drei EWS Zelllinien und vor allem nicht selektiv gegenüber MSC. Zelltod konnte durch ATO, Etoposid und Doxorubicin in allen EWS Zelllinien, nicht aber in MSC induziert werden. Dieser Effekt wurde mit der Kombination von ATO und Etoposid noch einmal potenziert. Die Kombination von ATO und Doxorubicin reduzierte die Viabilität ebenfalls signifikant, verglichen mit der Einzelgabe. Eine dreifache Kombination aus ATO, Etoposid und Doxorubicin zeigte jedoch keinen zusätzlichen Nutzen im Vergleich zu den Zweifach-Kombinationen. Die bisherigen Ergebnisse deuten darauf hin, dass ATO zur Erhöhung der Überlebensraten von EWS Patienten und zur Reduzierung von Resistenzen gegen Chemotherapeutika in aggressiven EWS beitragen kann. Durch die reduzierte Dosis der kombinierten Substanzen können Nebenwirkungen der Chemotherapeutika vermindert werden. Vor einem potenziellen klinischen Einsatz werden allerdings weitere Informationen über die detaillierten Wirkmechanismen in EWS benötigt.

Ewing sarcoma (EWS) are mesenchymal tumours usually occurring in children and adolescents. Currently, patients with non-metastatic EWS show 5-year survival rates above 70 % when treated radically with surgery, chemotherapy and radiotherapy, whereas relapsed or metastasised EWS are more difficult to treat. One of many reasons is the increasing drug resistance in relapsed EWS including the expression of ABC transporters such as PGP or MRP1 which transport cytostatic drugs back through the cell membrane into the extracellular matrix. Furthermore, EWS express the characteristic EWS-FLI1 fusion protein which also modulates the GLI proteins in the Hedgehog (Hh) pathway. Aberrant Hh-signalling has been observed in several malignancies including EWS and correlates with cancer formation and progression. As the Hh pathway directly targets expression of ABC transporter proteins, GLI inhibition as additional therapeutic option to overcome multi drug resistance was investigated. In the present study viability, colony formation, growth of 3D cultures and induction of cell death was analysed in three EWS cell lines treated with the GLI inhibitors GANT61 and ATO as well as the established cytostatics etoposide and doxorubicin using MTS assay, clonogenic assay, 3D spheroid assay, flow cytometry and western blot. ATO, etoposide and doxorubicin reduced viability significantly and selectively in all three EWS cell lines in comparison to mesenchymal stem cells (MSC). On the other hand, GANT61 was less efficient in two of three EWS cell lines and particularly not selective compared to MSC. Cell death was induced by ATO, etoposide and doxorubicin in all three EWS cell lines, but not MSC. The combination of ATO and etoposide potentiated this effect. The combined application of ATO and doxorubicin also significantly compromised viability compared to individual treatment. However, a triple combination of ATO with both cytostatics did not compromise cells more than the double combinations. The present results indicate that ATO is effective in EWS. Therefore, ATO may contribute to increased survival rates of patients with EWS and especially reduce resistance of aggressive EWS against chemotherapeutics. Furthermore, as doses for drugs can be reduced in combined treatment, adverse effects of chemotherapy may be diminished. However, further evaluation of the detailed inhibitory mechanisms in EWS is needed before transferring this approach to the clinic.