Development and Optimization of Targeted/Untargeted Lipidomic Screening Methodologies in Pharmaceutical and Clinical Bioanalysis by Liquid Chromatography-High Resolution-Mass Spectrometry

Abstract

In den vergangenen Jahrzehnten haben beachtliche technologische Innovationen in der Massenspektrometrie (MS) einen kontinuierlichen Fortschritt der analytischen Chemie vorangetrieben und die Erforschung verschiedener „Omik“ Bereiche beschleunigt. Die Lipidomik, ein Teilgebiet der Metabolomik, hat in letzter Zeit zunehmend Aufmerksamkeit erregt, da Lipiden ein signifikanter Einfluss beim Ausbruch und Verlauf von weitläufigen Krankheiten wie Krebs oder Herz-Kreislauf-Erkrankungen zugesprochen wird. Dies ist vor allem auf ihre vielfältigen physiologischen Aufgaben, z.B. als Membranbausteine, Energiespeicher und Signalmoleküle, zurückzuführen. Neben der verbesserten Geräteleistung haben sich auch die analytische Herangehensweise und die Methoden der Bioinformatik weiterentwickelt. Hierdurch wurden Grundlagen für eine zuverlässige Qualifizierung und Quantifizierung geschaffen, die bei der stetigen Entschlüsselung des Lipidoms sowie der damit verbundenen Stoffwechselwege und metabolischen Netzwerke, hilfreich sind. Damit eine ausreichende Empfindlichkeit, Selektivität und Analytabdeckung erreicht werden kann, setzt man häufig Quadrupol-Flugzeit-Massenspektrometer (QTOFs) ein, da ihre schnellen Aufnahmegeschwindigkeiten die Generierung von hochauflösenden Massenspektren während der Kopplung an Ultra-Hochleistungs-Flüssig-Chromatographie (UHPLC) erlauben. Mit der Einführung einer ergänzenden Akquisitionstechnik namens SWATH (engl.: sequential window acquisition of all theoretical fragment-ion spectra) wurde ein leistungsstarkes Hilfsmittel für eine umfassende Analytik zur Verfügung gestellt. In der folgenden Arbeit wurde das Potenzial eines UHPLC-QTOF Instruments genutzt, um bei der Untersuchung des Lipidoms in biologischen Proben den maximalen Informationsgewinn zu erzielen. Neben dem Vergleich verschiedener Extraktionsprotokolle für HeLa-Zellen wurde zudem die Entwicklung einer spezialisierten Probenaufbereitungsmethode für Plasma-Steroide durchgeführt. Mit Hilfe von SWATH und einer sorgfältigen Optimierung der massenspektrometrischen Parameter, wurden Bestimmungsgrenzen im niedrigen picomolaren Bereich für Testosteron und Estradiol erreicht. Ein Hindernis bei der Quantifizierung endogener Verbindungen ist üblicherweise das Fehlen einer echten Leermatrix. Dies konnte jedoch durch den Einsatz einer sogenannten Surrogat-Kalibrierung mittels 13C3-markierten Analoga der Zielanalyte kompensiert werden. Die fertige Methode wurde nach internationalen Richtlinien validiert und Präzision und Richtigkeit wurden zusätzlich über externe Qualitätskontrollproben bestätigt. Anschließend wurden über 300 klinische Proben vermessen. Anhand der erhaltenen Ergebnisse konnte der Einfluss einer Estradiol-Behandlung auf die Nahrungsaufnahme bei männlichen Probanden überwacht und interpretiert werden. Dabei wurde ein verringerter Proteinkonsum festgestellt, der unabhängig von Veränderungen der Makronährstoffaufnahme ist, welche durch Insulingabe induziert werden. Durch das kombinierte Studiendesign, welches neben den Zielanalyten eine ungezielte Detektion von Analyten erlaubt, war es zudem möglich nach weiteren Steroiden in den Proben zu suchen. Hierdurch konnte gezeigt werden, dass eine signifikante Abnahme der Epitestosteron-, Dihydrotestosteron- sowie Hydroxyprogesteron-Level durch die Einnahme von Estradiol verursacht wurde. Des Weiteren wurden im Rahmen einer anderen Studie, welche ausschließlich auf die ungezielte Detektion von Analyten ausgerichtet war, verschiedene Methoden zur Normalisierung beurteilt. Diese werden für gewöhnlich angewendet um ungewollte Variationen in den Proben zu verringern. Nachdem ein auf Qualitätskontrollproben basierender Arbeitsablauf zur effektiven Beurteilung der Güte einer Normalisierung zusammengestellt wurde, konnten neue Richtlinien zur Auswahl der bestmöglichen Strategie vorgeschlagen werden. Ein wichtiger Aspekt war dabei auch, die Überprüfung der Plausibilität der Daten nach der Normalisierung. Darüber hinaus wurde ein bioinformatisches und statistisches Open Source Skript zur Verfügung gestellt, welches eine vereinfachte Implementierung der formulierten Richtlinien in bestehende Abläufe zur Datenprozessierung gewährleisten kann. Dadurch wurde letztendlich ein Beitrag für die wissenschaftliche Gemeinschaft erbracht, der zur erforderlichen Harmonisierung der Datenhandhabung bei ungerichteten Lipidomanalysen genutzt werden kann. Trotz des erhöhten Aufwands bei ungerichteten Analysen, wird bei den meisten Studien nur eine relative Quantifizierung erzielt. Ohne absolute Konzentrationsangaben ist die Vergleichbarkeit mit anderen Studien oder Datenbanken jedoch eingeschränkt und Folgeversuche zur Abschätzung von abnormalen Konzentrationen oder Referenzbereichen potenzieller Biomarker müssen unternommen werden. Um diesem Problem entgegenzuwirken wurde eine Studie initiiert, bei der deuterierte, Lipidklassen-spezifische Standardsubstanzen als Surrogat-Kalibranten verwendet wurden. Hierdurch sollte eine klassenbasierte Quantifizierung realisiert werden. Kalibranten und Qualitätskontrollproben der Surrogat-Substanzen wurden in unbehandeltem Plasma hergestellt und in die Sequenz einer ungerichteten Plasmalipid-Studie eingebettet. Dabei wurde die Präzision und Richtigkeit der Surrogat-Kalibranten überprüft und validiert. Die einzelnen Lipidspezies wurden über eine Umkehrphasen-UHPLC Methode getrennt und mittels SWATH analysiert. Aufgrund von abweichenden Ionisierungseffizienzen und Unterschieden in der Signalstärke zwischen Lipidspezies, welche von der Kettenlänge, vom Sättigungsgrad, von Matrixeffekten und von der Zusammensetzung der mobilen Phase während der Elution abhängen, mussten sogenannte Response-Faktoren beachtet werden um eine klassenweite Extrapolation der Ergebnisse zu gewährleisten. Es wurde aufgezeigt, dass die Surrogat-Kalibrierung eine genauere Quantifizierung von Lipiden erlaubt als eine Ein-Punkt-Kalibrierung. Durch eine neu formulierte Strategie der „Post-Akquisition Re-Kalibrierung“, welche die experimentelle Bestimmung von Response-Faktoren für Lipide von besonderem Interesse nach der Messung und Datenprozessierung beschreibt, wurde ein möglicher Arbeitsablauf angedeutet, mit dem eine Abschätzung von Lipidgehalten in ungezielten Analysen vollzogen werden kann.

Throughout the last decades, substantial technological innovations in mass spectrometry (MS) fueled a continuous progress in analytical chemistry and enabled the accelerated exploration of various “omics” branches. Lipidomics, a subset of metabolomics, has recently attracted increasing attention, since lipids, with their diverse physiological functions as structural components of membranes, energy depots and signaling molecules, have been recognized as significant factors in disease onset and progression, e.g. for central health concerns like cardiovascular disease and cancer. Besides the improved instrument hardware, also analytical strategies and bioinformatics have advanced to yield reliable qualification and quantification, which aid in the ongoing decryption of the lipidome and its pathways and networks. To obtain sufficient sensitivity, selectivity and analyte coverage, hybrid quadrupole time-of-flight (QTOF) mass spectrometers are often utilized, as their rapid acquisition rates allow to combine the recording of high resolution mass spectra with the hyphenation to ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC). Along with the introduction of sequential window acquisition of all theoretical fragment ion mass spectra (SWATH), a powerful tool for true comprehensive analysis was made available. In this thesis, the potential of a UHPLC-QTOF platform was exploited to achieve a maximum yield of extractable information from biological samples in the context of lipidomic workflows. Besides the comparison of different lipid extraction strategies for HeLa cells, also the development of a specialized sample preparation protocol for plasma steroids was conducted. Together with SWATH acquisition and a thorough optimization of MS parameters, absolute quantification of low picomolar levels of testosterone and estradiol was attained. An obstacle for the quantification of endogenous compounds is typically the lack of a true blank matrix, which was compensated by surrogate calibration via 13C3-labeled target analyte analogues. The established method was validated according to international guidelines and the accuracy and precision were additionally verified by the analysis of external quality control (QC) samples. Later, over 300 clinical samples were analyzed and the obtained results were utilized to monitor and interpret the influence of estradiol treatment on food intake in healthy men. The observed lowered protein consumption was shown to be independent from alterations in macronutrient ingestion induced by insulin administration. Furthermore, the merged targeted/untargeted study design enabled simultaneous screening of additional steroids and revealed a significant reduction in epitestosterone, dihydrotestosterone and hydroxyprogesterone levels after estradiol intake. Moreover, in the framework of an exclusively untargeted lipidomic study, different normalization strategies, which are usually required to control for unwanted variation, were assessed. After compiling a QC-based workflow to effectively compare the performance of normalization methods, novel guidelines for selecting the best suitable strategy, while maintaining data integrity, were proposed. In addition, a script-based statistical and bioinformatical tool was provided as an open source solution to facilitate the implementation of these guidelines into the existing data processing workflows. Eventually, a contribution towards the necessary harmonization of data handling approaches in untargeted lipidomics was supplied for the scientific community. In spite of the increasing efforts in untargeted analysis, the majority of studies is still only able to report results as relative foldchanges. Without absolute quantification, though, comparability to other studies or databases is limited and follow-up experiments have to be conducted to estimate reference or abnormal levels of potential biomarkers. To overcome this issue, a study with deuterated, lipid class-specific standards as class-wide surrogate calibrants was designed. Matrix-matched calibrants and QCs were incorporated into the analytical sequence of an untargeted plasma study and precision and accuracy for representative surrogate lipids was validated. Lipid species were separated with a reversed-phase UHPLC method and data was acquired using SWATH. Due to different ionization efficiencies and instrument responses between lipid species, which depend on carbon chain length, degree of saturation, matrix effects and solvent composition during elution, response factors had to be considered for class-wide extrapolation of absolute concentrations. It could be demonstrated that surrogate calibration resulted in more accurate quantification of lipid levels than one-point calibration. With post-acquisition re-calibration, which is describing the experimental determination of response factors after analysis and data processing for lipids of interest, a workflow, that is capable to estimate lipid levels in untargeted assays, was suggested.