Applikation der ENTPDase CD39 zur Inhibition der Aktivierung von Thrombozyten und Leukozyten während systemischer Inflammation

Abstract

Die systemische Inflammation (SIRS) bzw. Sepsis stellt eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität in der Intensivmedizin dar. Während systemischer Inflammation kommt es zur Ausschüttung proinflammatorischer Mediatorsubstanzen, die nachfolgend eine generalisierte Aktivierung und Interaktion zwischen Thrombozyten, Leukozyten und dem Gefäßendothel induzieren. Im Rahmen einer septischen Vaskulopathie bleiben Thrombozyten-Granulozyten-Komplexe (TGK) in der Mirkozirkulation haften und können diese okkludieren. Im Weiteren wird die transendotheliale Migration von Leukozyten in entzündetes bzw. infiziertes Gewebe vermittelt. Auf diese Weise wird somit ein inflammatorischer Organschaden vermittelt. Auf Basis dieser Vorgänge wurde als Ziel dieser Arbeit die Inhibition Sepsis-assoziierter Komplikationen durch Applikation von Molekülen mit Apyrase-Aktivität, inklusive CD39 (NTPDase-1) entwickelt. CD39 metabolisiert den Thrombozyten-Agonisten Adenosindiphosphat (ADP) und begünstigt damit die Bildung von anti-inflammatorischem Adenosin. Das in den Untersuchungen unter anderem eingesetzte Fusionsprotein targ-CD39, bestehend aus CD39 und einem Antikörper gegen den aktivierten thrombozytären GPIIb/IIIa-Rezeptor, ermöglicht die CD39-Wirkung gezielt in den Bereich aktivierter Thrombozyten zu fokussieren. Durch diesen spezifischen Effekt von targ-CD39 lassen sich – wie bereits in Vorarbeiten in einem Thrombosemodell gezeigt – Nebenwirkungen von Thrombozyteninhibitoren wie z.B. ein erhöhtes Blutungsrisiko vermeiden. Als Kontrollsubstanzen dienten in den Untersuchungen das unspezifische Fusionsprotein nontarg-CD39, sowie Kartoffel-Apyrase, welche beide ebenfalls ADP spalten, jedoch eine generalisierte CD39 Wirkung mit erhöhter Blutungsgefahr entfalten. In initialen in vitro Experimenten wurde der Effekt von Kartoffel-Apyrase auf die Aktivierung und Interaktion von Thrombozyten und Leukozyten analysiert. Weiter wurden in einem durch intraperitoneale LPS-Injektion induzierten Sepsismodell mit C57BL/6 Mäusen Kartoffel-Apyrase, targ-CD39, sowie nontarg-CD39 als unspezifische Kontrollsubstanz in äquimolarer Dosierung (0,4 µg/g) intravenös appliziert. Mittels Intravitalmiksokopie wurden in postkapillären Venolen der Cremaster-muskulatur Thrombozyten-Leukozyten-Endothel Interaktionen und die Extravasation von Leukozyten untersucht. In murinem Vollblut wurde durchflusszytometrisch die Bildung von TGK, sowie der Aktivierungszustand komplexgebundener Granulozyten und Thrombozyten analysiert. In Organgewebe (Peritoneum, Leber und Niere) wurde mit immunhistochemischen Färbungen die Extravasation von Leukozyten untersucht. Aus den Untersuchungen der vorliegenden Arbeit ergab sich, dass die Behandlung mit targ-CD39, nontarg-CD39 bzw. Kartoffel-Apyrase die Thrombozyten-Endothel-Interaktion sowie die Extravasation von Leukozyten reduziert. Gleichzeitig wurde die Leukozyten-Rollgeschwindigkeit durch die Applikation von targ-CD39 gesteigert. Die Bildung von TGK wurde effektiv durch die Testsubstanzen verhindert. In immunhistochemischen Färbungen des Peritoneums, der Niere und der Leber zeigten sich nach Behandlung mit targ-CD39 signifikant weniger migrierte TGK. Diese günstigen Effekte der Applikation von spezifisch auf aktivierte Thrombozyten wirkendes targ-CD39 mit Reduktion Inflammations-assoziierter Komplikationen im murinen Sepsismodell lassen targ-CD39 als einen vielversprechenden Ansatz in der Therapie systemischer Inflammation erscheinen. Daher sollte die Behandlung mit targ-CD39 in weiterführenden Studien (klinisch sowie experimentell) bei Patienten mit SIRS bzw. Sepsis weiterentwickelt und untersucht werden.