Die Bedeutung von Atf6 für die Zebrafischretina: Generierung und Charakterisierung eines atf6-/- - Zebrafischmodells

Abstract

Mutationen im ATF6-Gen verursachen autosomal rezessive Achromatopsie beim Menschen. Alle bisher mit Achromatopsie assoziierten Gene kodieren für funktionelle Bestandteile der Phototransduktionskaskade im Zapfen-Photorezeptor. Im Gegensatz dazu besitzt ATF6 keine spezifische oder exklusive Funktion in der Phototransduktion. ATF6 kodiert für den ubiquitär exprimierten Aktivierenden Trankriptionsfaktor 6, der eine bekannte Schlüsselfunktion bei der Regulation der UPR und der zellulären Homöostase des ERs spielt. Warum ATF6 als ubi-quitär exprimierter Transkriptionsfaktor in seiner mutierten Form ausschließlich zu einem retinalen Phänotyp im Menschen führt, sollte in dieser Arbeit unter Verwendung eines eigens generierten Zebrafischmodells untersucht werden. Da bislang nicht untersucht wurde, wo atf6 in der Retina exprimiert wird, wurden ISH-Experimente zur Lokalisation von atf6 in der Zebrafischlarve durchgeführt. atf6 konnte in sich in der Entwicklung befindenden Photorezeptoren, in Amakrinzellen und in Zellen der peripheren, der CMZ zugewandten Bereichen der Ganglienzellschicht sowie der CMZ in der larvalen Zebrafischretina lokalisiert werden. Vergleicht man im Alter von 3 dpf die Lokalisa-tion der Expression von atf6 mit der der atf6 Zielgene hspa5 und hspa90b1 sowie von atf6β, zeigten sich teilweise überlappende Expressionsmuster aller Zielgene. Mittels dieser Ergeb-nisse konnte gezeigt werden, dass die UPR während der retinalen Entwicklung aktiv und von Bedeutung ist. Um Informationen über den Pathomechanismus der ATF6-assoziierten Achromatopsie zu erhalten, wurde mithilfe der TALEN-Technologie ein atf6-/--Zebrafischmodell generiert, wel-ches eine Deletion in Exon 6 des atf6-Gens (c.519delG;p.V174fs*42) trägt. In vorherigen in silico Analysen wurde zudem sicher gestellt, dass atf6 nur einmal im gesamten Zebrafischge-nom vorliegt und nicht im Zuge der Genom-Duplikation während der Entwicklung der Teleostei dupliziert wurde. Die Charakterisierung des Fischmodells erfolgte über immunhistologische Färbungen sowie funktionelle Untersuchungen. Die histologische Analyse zeigte eine im frühen Larvenstadium auftretende, durch den Verlust von atf6 bedingte, retinale Entwicklungsverzögerung, die sich mit fortschreitendem Alter wieder zurückbildete. Die Entwicklungsverzögerung betraf alle Schichten der Retina und äußerte sich in Form einer verminderten Zahl an Zapfen-Photorezeptoren, Bipolarzellen sowie Ganglienzellen. Elektroretinographische Untersuchun-gen zeigten, dass die visuelle Funktion in atf6-defizienten gegenüber wildtypischen Larven eingeschränkt ist. Untersuchungen, die Auskunft über das Proliferationspotential und die Zell-todrate geben und damit eine mögliche Erklärung für die verminderten Zellzahlen in der atf6-defizienten Retina aufzeigen sollten, lieferten keine Hinweise auf ein verändertes Proliferati-onsverhalten oder eine gesteigerte Zelltodrate in der atf6-defizienten Retina. Ob der Verlust von atf6 in einer erhöhten Anfälligkeit gegenüber UPR-induzierender Substanzen resultiert und der retinale Phänotyp in atf6-defizienten Zebrafischlarven hierdurch intensiviert wird, wurde an mit Tunicamycin-behandelten Zebrafischlarven untersucht. Die histologische Ana-lyse der behandelten wildtypischen und atf6-defizienten Larvenretinae zeigte, dass die phar-makologische Induktion der UPR mittels Tunicamycin lediglich einen Einfluss auf die Zahl der Bipolarzellen in der atf6-defizienten im Vergleich zur wildtypischen Retina ausübt. Diese waren in der atf6-defizienten gegenüber der wildtypischen Retina in ihrer Zahl im Alter von 5 dpf reduziert. Die Zahl der Zapfen-Photorezeptoren als auch die Zahl der Ganglienzellen blieb trotz der Tunicamycin-Behandlung unverändert. Um zu überprüfen, ob der Verlust von atf6 die Expression von Zielgenen der UPR, wie hspa5 und hsp90b1 aber auch atf6β beeinflusst, wurden Expressionsanalysen mittels qRT-PCR-Experimenten im Larvalstadium (3 dpf und 5 dpf) und der adulten Zebrafischretina durchge-führt. Im Alter von 3 dpf und 5 dpf wurden keine Unterschiede in der Expression der atf6-Zielgene hspa5 und hsp90b1 detektiert. Die Expression von atf6β war in den untersuchten Larvalstadien jedoch signifikant erhöht, was auf einen kompensatorischen Mechanismus von atf6β bei vorliegendem Verlust von atf6 während der Entwicklung des Zebrafisches hinweist. Abschließend ist festzustellen, dass Atf6 eine Rolle in der retinalen Entwicklung spielt, das atf6-/--Zebrafisch-Model jedoch leider kein geeignetes Model für die ATF6-assoziierte ACHM beim Menschen darstellt.

Mutations in the ATF6 gene cause achromatopsia in humans, a rare stationary autosomal re-cessively inherited retinal disorder characterized by the lack of cones photoreceptor function. In contrast to all other known disease causing genes, ATF6 does not encode for a component of the phototransduction cascade but for the activating transcription factor 6, a ubiquitously expressed transcription factor and key component of the unfolded protein response (UPR) responsible for cellular homeostasis and ER function. So far, the localization of ATF6 expression in the retina has not been analyzed. To reveal its expression pattern, ISH experiments using riboprobes against atf6 were performed on zebrafish larvae. In 3 dpf old larvae atf6 expression localizes in developing photoreceptors, in amacrine cells as well as in the peripheral regions of the ganglion cell layer close to the CMZ and in the CMZ itself. A comparison of the atf6 expression pattern with those of its down-stream targets as well as atf6β revealed a partially overlapping expression pattern for all target genes at this developmental age. In conclusion, these data indicate that the UPR is activated during early retinal development in the zebrafish. To unravel the mechanism of how mutations in this ubiquitously expressed gene result in a sole retinal phenotype, an atf6-/--zebrafish model was generated using TALEN-technology and atf6-/--zebrafish line was established. The atf6-/--zebrafish model carries a 1 bp deletion in exon 6 of the atf6 gene predicted to result in a severely truncated protein (c.519delG;p.((V174fs*42) lacking all structural and functional domains of the atf6 polypep-tide. Since the zebrafish genome was duplicated during teleosts development, the presence of just a single atf6α copy was assured using in silico analysis tools. The histological characterization of the atf6-deficient retina revealed an atf6-dependent delay in the retinal development of young (3 dpf and 5 dpf) larvae in comparison to WT animals at a comparable age. This delay was no longer detectable in more advanced larval stages (15 dpf) as well as in the retinae of adult fish. Notably, the developmental delay affects all retinal layers resulting in reduced numbers of cone photoreceptors, bipolar cells and ganglion cells. The functional assessment of the retina using ERG measurements substantiates the histological results. atf6-deficient larvae exhibit a significantly reduced b-wave amplitude. However, investigations of the proliferative potential and the cell death rate could not explain the differences in the retinal cell numbers between WT and atf6-/--zebrafish larvae. To further test whether the loss of atf6 leads to an increased susceptibility to ER stress, zebrafish larvae were treated with the ER stress inducing agent Tunicamycin. The histological analysis of retinae obtained from Tunicamycin treated larvae revealed that merely the bipolar cells in WT retinae are affected by the Tunicamycin treatment. Here, the number of bipolar cells was significantly reduced at 5 dpf in comparison to atf6 deficient retinae. However, cones and ganglion cells remained unaffected in both lines. These data suggest that the loss of atf6 does not deeply increase the vulnerability of retinal cells to ER stress. To examine whether the loss of atf6 results in an expressional dysregulation of other atf6 as-sociated UPR components, qRT-PCR experiments were performed for several downstream targets of atf6. The results of the expression analysis displayed no changes in the expression levels of both atf6 downstream target genes hspa5 and hsp90b1 in 3 dpf and 5 dpf old larvae. However, expression of atf6β was highly up-regulated at both developmental stages indicating a compensatory mechanism of atf6β during larval development in case atf6 is lost. In conclusion, atf6 plays a role in the development of the retina, but the atf6-/--zebrafish is not a suitable model for ATF6-associated ACHM.