Inhaltszusammenfassung:
Die Familie der Brassinosteroid-Pflanzenhormone (BR) ist an der schnellen Kontrolle des Zellstreckungswachstums beteiligt. Die Aktivierung des plasmamembran-ständigen Brassinosteroidrezeptors BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1 (BRI1) und seines Cofaktors BRI1-ASSOCIATED KINASE (BAK1) führt zur Dissoziation des Inhibitors BAK1-INTERACTING RECEPTOR-LIKE KINASE 3 (BIR3) und schließlich zur Aktivierung von P-Typ ATPasen (AHAs). Die aktivierung der Protonenpumpen (AHAs) führt zu einer Ansäuerung des extrazellulären Raums, einer Hyperpolarisierung der Plasmamembran und einer Lockerung der Zellwand, was schließlich zu Zellstreckungswachstum führt. Dieses Signaltransduktionsmodul ist auf Komponentenebene gut beschrieben. Es ist jedoch noch nicht bekannt, wie diese Akteure räumlich und zeitlich zusammenwirken, um das unterschiedliche Zellstreckungswachstum als Reaktion auf BR in verschiedenen Pflanzengeweben zu vermitteln. Hier zeigen wir durch quantitative in vivo-Ansätze, dass sich die Proteinmenge von AHA2 in der schnell wachsenden Elongationszone von der in der weniger / nicht wachsenden meristematischen und Wurzelhaarzone in der Wurzel von Arabidopsis thaliana unterscheidet. Während das Proteinverhältnis von BIR3 und BRI1 entlang der Wurzelachse gleich bleibt, ist das Verhältnis von AHAs und BRI1 in der meristematischen Zone signifikant niedriger. Unter Einbeziehung der Proteinmengen in ein mathematisches Modell untersuchen wir die Regulation und Dynamik des schnellen BR-Antwortmoduls in silico, einschließlich der Membranhyperpolarisation und des Zellstreckungswachstums. Sowohl das Modell als auch die Experimente unterstreichen die Bedeutung der Protonenpumpen in Kombination mit dem Hormonrezeptor. Unter Berücksichtigung der unterschiedlichen Proteinspiegel kann das Modell das unterschiedliche Wachstumsverhalten entlang der Wurzelachse beschreiben, einschließlich nicht-invasiver Protonenflussmessungen und apoplastischer pH-Messungen. Wir nehmen daher an, dass das Verhältnis von AHAs zu BRI1 der entscheidende Parameter ist, der die differentielle Fähigkeit von Zellen steuert, sich als Reaktion auf BR entlang der Wurzelachse zu verlängern. Es ist auch noch nicht geklärt, ob die Aufteilung der Komplexe in der Plasmamembran (Mikrodomänen) für die physiologische Leistung, nämlich das Zellstreckungswachstums, relevant ist. Unter Verwendung der photoaktivierten Lokalisationsmikroskopie mit Einzelpartikelverfolgung (sptPALM) fanden wir, dass die Mehrheit der BRI1-Rezeptoren in Tabakblättern (Nicotiana benthamiana) ein subdiffusives Verhalten zeigt. Dieses heterologe System ist jedoch vermutlich nicht gut für den Nachweis geringfügiger Änderungen der Rezeptordynamik geeignet, da weder die BR-Behandlung noch das Aufbrechen von Mikrodomänen mit Methyl-Beta-Cyclodextran (MbCD) und die Depolymerisation von Aktinfilamenten die BRI1-Rezeptordynamik signifikant veränderten. Im Gegensatz dazu, schwächt die Störung der Mikrodomänen durch MbCD in Arabidopsis thaliana die Brassinosteroid-Signalübertragung in Bezug auf primäres Wurzelwachstum und Wurzelwellen ab, was darauf hinweist, dass die Integrität der PM-Mikrodomänen für die BRI1- Funktion entscheidend ist. Es ist derzeit nicht klar, ob BRI1, BAK1 und das die Zellwandintegrität erfassende RECEPTOR LIKE PROTEIN 44 (RLP44) gleichzeitig in derselben Mikrodomäne lokalisiert sind und einen Trimerkomplex bilden. Hier liefern wir durch quantitative in vivo FRETFLIM- Messungen mit drei Fluorophoren den Nachweis, dass RLP44, BRI1 und BAK1 in der Plasmamembran von Nicotiana benthamiana-Blattzellen in Abwesenheit von exogenem BR einen Trimerkomplex bilden, wobei der geschätzte Abstand zwischen ihnen unter 15 nm liegt. Der Immunrezeptor FLAGELLIN SENSING 2 (FLS2), der strukturell BRI1 ähnlich ist, ist nicht in einen ähnlichen Komplex mit RLP44 und BAK1 integriert. Unsere Studie belegt, dass BRI1 und FLS2 in der Plasmamembran in unterschiedlichen Nanodomänen lokalisiert sind. Darüber hinaus scheint RLP44 spezifisch für BRI1-haltige Mikrodomänen zu sein, da FRET mit FLS2 nie beobachtet wurde. Da die Fluoreszenzlebensdauer des Donors überwacht wird, umgeht unsere Methode die umfangreichen Berechnungen, die für intensitätsbasierte FRET-Interaktionstests erforderlich sind, und bietet somit eine praktikable Grundlage für die Untersuchung der Subkompartimentierung in der Plasmamembran lebender Pflanzenzellen mit einer Auflösung im Nanomaßstab.
Three-fluorophore FRET-FLIM
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