Inhaltszusammenfassung:
Nonsense mediated decay (NMD) ist ein mRNA-Kontrollmechanismus in Eukaryoten, der eine Vielzahl von Transkripten reguliert. Daher hat er auch einen großen, direkten Einfluss auf die Expression vieler Gene. NMD spielt eine zentrale Rolle in der Pflanzenentwicklung und ist Teil von vielen Stressantworten. Salzstress ist eine große Bedrohung für Nutzpflanzen weltweit, und hat außerdem einen Einfluss auf NMD. Um die zugrundeliegenden Mechanismen der durch Salzstress vermittelten Beeinträchtigung des NMD näher zu untersuchen, wurde zuerst eine zuverlässige Methode zur Messung des RNA Abbaus etabliert. Mittels dieser Messmethode konnte gezeigt werden, dass die Salzstress-vermittelte Inhibition des NMD Dosis abhängig ist, sowie spezifisch auf den Mechanismus des NMD wirkt, und nicht von einer allgemeinen Beeinflussung der RNA Abbauprozessen her rührt. Die Salzstress vermittelte NMD Inhibition scheint spezifisch für NaCl zu sein, da andere Salze wie z.B. KCl keinen vergleichbaren Effekt zeigen. Zudem weisen einige Transkripte zentraler NMD Komponenten NMD auslösende Charakteristika auf, was uns dazu veranlasste, NMD vermittelte Rückkopplungseffekte an diesen Transkripten zu untersuchen. Mittels der von uns etablierten Methode zur Erfassung von RNA Abbauprozessen sowie verschiedenen NMD defizienten Mutanten gelang es uns zu zeigen, dass tatsächlich einige dieser Transkripte selbst einer Regulation durch NMD unterliegen. Die in NMD Mutanten auftretende Stabilisierung dieser Transkripte wurde unter Salzstress noch verstärkt. Dies weist daraufhin, dass die noch teilweise Erhaltene NMD Funktion der Mutanten durch applizierten Salzstress weiter verringert werden kann. Im Bestreben übergeordnete, regulatorische Prozesse zu identifizieren, wurde festgestellt, dass Abszisinsäure (ABA) weder ausreicht, noch benötigt wird für Salzstress abhängige NMD Inhibition. Die untergeordneten SNF1-RELATED KINASES 2 (SnRK2s) ist ebenfalls unbeteiligt, was anhand von Analysen der Klasse I und III SnRK2 Mutanten gezeigt werden konnte. SnRK2s und das davon phosphorylierte VARICOSE (VCS) wurden überprüft, da andere Studien eine Rolle in die Regulation von mRNA Stabilität während Salzstress zeigten. Die Reduktion der VCS Expression in VCS amiRNA Linien zeigte eine Inhibition von NMD regulierten Transkripten unter Kontrollbedingungen, jedoch keinen signifikanten Effekt unter Salzstress im Vergleich zum Wildtyp (WT). Des Weiteren weist NMD eine enge Verbindung zu Translationsprozessen auf. Die Applikation des Translations-Elongations Inhibitors Cycloheximid hat die Akkumulation von NMD regulierten Transkripten zur Folge. Dies legt nahe, dass eine NMD Inhibition die Beeinträchtigung der Translations-Elongation zur Folge hat. Dennoch konnte durch die Applikation von Chlorsulfuron, einem Induktor der Phosphorylierung des EUKARYOTISCHEN INITIATIONSFAKTORS 2 a (eIF2a), kein Effekt auf den Abbau von NMD regulierten Transkripten festgestellt werden. Ein Effekt war ebenfalls nicht detektierbar in gcn2 (general control nondepressible 2 ) Linien. GCN2 vermittelt in-vivo die eIF2a phosphorylierung. Auch andere Stressfaktoren wie z.B. Hitzestress wurden untersucht. Bei 30 _C konnte ein beschleunigter Abbau von regulierten Transkripten festgestellt werden, bei 38 _C hingegen eine Stabilisierung derselben. Ausgehend von jüngster Literatur, könnte dies von der Bildung von Hitzestress-Körperchen (Heat stress-granules) bei 34 _C herrühren. Unter Kontrollbedingungen scheinen Pflanzen mit mutierten Decapping Komponenten, die mit UP-FRAMESHIFT PROTEIN 1 (UPF1) interagieren, und des Weiteren Bestandteile von P-bodies und Stress-Körperchen (Stress granules) sind, NMD regulierte Transkripte beeinflussen. Unter Salzstress zeigen diese jedoch nur minimale Änderungen in Ihrer Expression im Vergleich zum WT. Basierend auf der schnellen und reversiblen (De-) Stabilisierung von NMD regulierten Transkripte, sind sehr wahrscheinlich Phosphorylierungsprozesse in die NaCl vermittelte NMD Inhibition involviert. Das Stabilisierungsmuster von NMD Transkripten unter Salzstress kann sowohl durch die Stimulation von cytosolischem Ca2+ Influx, als auch durch externe H2O2 Applikation nachgeahmt werden. Eine mittels Paraquat Behandlung ausgelöste Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) Akkumulation in den Chloroplasten hingegen zeigte keinen Einfluss. Die SALT OVERLY SENSITIVE (SOS) Mutanten sos1-1 und sos2-2 zeigen eine Hyperstabilisierung von NMD regulierten Transkripten, sos3-1 jedoch zeigen keinen Effekt. In einem Phos-Tag Gel konnte SUPPRESSOR WITH MORPHOLOGICAL DEFECTS IN GENITALIA 7 (SMG7) in sos2-2 Pflanzen nicht nachgewiesen werden. Auf dem entsprechenden Western-Blot war der Nachweis möglich, was die Folge einer suboptimalen Extraktion des phosphoryliertem SMG7 sein könnte. Zusammen mit den Daten der Ca2+ und der H2O2 Experimente, sowie von neuesten Publikationen, schlage ich einen Mechanismus vor, in welchem SMG7 Ca2+ abhängig phosphoryliert wird, was wiederum unter anderem durch apoplastisches H2O2 im Rahmen einer Salzstress Antwort ausgelöst wird. Ausgehend von diesem Modell wird mittels des Phosphorylierungsstatus von SMG7 die NMD Effizienz moduliert, was wiederum eine dosis-abhängige Feinjustierung der Transkriptkontrolle in der Zelle erlaubt.
Abiotic stress
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