Structural and functional studies of the Scavenger Decapping Enzyme DcpS

Abstract

Messenger RNA (mRNA) is the working copy of a gene containing the information for the production of a specific protein. The amount of any given protein has to be adjusted to the current needs of a cell. One mechanism for the regulation of protein production is the targeted degradation of the corresponding mRNA. A key element of an mRNA molecule is its 5’ cap structure that serves as a binding hub for interacting proteins and as a protection against premature degradation. During regulated mRNA degradation, the RNA body can be degraded by the exosome complex from the 3’ end, which leaves short capped RNA fragments. The cap structure of these fragments is removed by the Scavenger Decapping Enzyme (DcpS). This dimeric enzyme has a bipartite active site which is constituted from residues of two domains. Substrate binding induces a see-saw like conformational change that closes the active site around the substrate. In this thesis, we show that this domain motion is essential for the catalytic activity of DcpS, but that under substrate excess these motions can be too fast to allow for efficient substrate turnover, resulting in a unique way of substrate inhibition. To date, the information on the structure and protein dynamics of DcpS during catalysis rely on the usage of cap analogues, representing only the cap structure itself and one nucleotide of the RNA body. The products of the exosomal degradation of mRNA and thus substrates of DcpS, however, are short capped RNA fragments. The synthesis of such capped RNA was not possible until now, and we therefore established a method for the large scale enzymatic capping of in vitro transcribed RNA that employs the capping enzyme of vaccinia virus. This allows us to produce homogeneous, capped RNA of different length enabling in-depth biochemical and biophysical studies of the DcpS enzyme. Activity assays of DcpS with capped RNA of different lengths showed a clear influence of substrate length on catalytic activity with a strong preference for substrates of up to two nucleotides. We show that longer RNA is incompatible with the catalytically required domain motions of DcpS, due to steric hindrance between the enzyme and the mRNA body. We show that the preference of DcpS for capped mono- and di-nucleotides is conserved in various species and that this length dependence is in accordance with our preliminary data on the product length of the exosome. From this we conclude that the biological function of the threshold in substrate usage of DcpS is based on a direct handover of RNA fragments from the exosome to DcpS to prevent the decapping of actively translated transcripts.

Messenger RNA (mRNA) ist die Arbeitskopie eines Gens, welche die Information zur Herstellung eines spezifischen Proteins trägt. Die Menge eines jeden Proteins muss an den ständig wechselnden Bedarf einer Zelle angepasst werden. Ein Mechanismus, die Proteinproduktion zu regulieren, ist der gezielte Abbau der entsprechenden mRNA. Ein wichtiges Element eines mRNA Moleküls ist seine 5‘-Cap-Struktur, welche als Plattform für Protein-Interaktionen, sowie als Schutz vor vorzeitigem Abbau dient. Während des regulierten Abbaus der mRNA, kann der RNA-Körper durch den Exosom-Komplex vom 3‘-Ende her abgebaut werden, was in kurzen gecappten RNA-Fragmenten resultiert. Die Cap-Struktur dieser Fragmente wird durch das Scavenger Decapping Enzym (DcpS) entfernt. Das dimere Enzym besitzt ein zweigeteiltes aktives Zentrum, welches sich aus Resten zweier Domänen zusammensetzt. Durch Substratbindung wird eine wippenartige Konformationsänderung ausgelöst, welche das aktive Zentrum um das Substrat schließt. Wir zeigen, dass diese Bewegung der Domänen für die katalytische Aktivität von DcpS essentiell ist. Allerdings kann die Bewegung unter Substratüberschuss zu schnell sein, um effektiven Substratumsatz zu gestatten, was in einer einzigartigen Weise der Substrat-Inhibierung resultiert. Bis heute beruhen alle Informationen über Struktur und Dynamik von DcpS auf Cap-Analoga, welche lediglich die Cap-Struktur selbst und das erste Nucleotid des RNA-Körpers repräsentieren. Allerdings sind die Produkte des exosomalen Abbaus der mRNA, und damit die Substrate von DcpS, kurze gecappte RNA-Fragmente. Da die Synthese solcher gecappter RNA bislang nicht möglich war, haben wir eine Methode für das enzymatische Capping von in vitro transkribierter RNA in großem Maßstab, beruhend auf dem Capping Enzym des Vaccinia Virus, entwickelt. Diese erlaubt es uns, homogene, gecappte RNA unterschiedlicher Länge herzustellen, welche eingehende biochemische und biophysikalische Untersuchungen des DcpS-Enzyms ermöglicht. Aktivitäts-Assays von DcpS mit gecappter RNA unterschiedlicher Länge zeigen einen klaren Einfluss der Substratlänge auf die katalytische Aktivität mit starker Präferenz für Substrate von bis zu zwei Nukleotiden. Wir zeigen, dass längere RNA die Bewegung der Domänen, welche für die erfolgreiche Katalyse notwendig ist, nicht induziert. Aus Strukturdaten können wir schließen, dass der Schließmechanismus des aktiven Zentrums aufgrund eines längerer RNA-Körpers sterisch behindert wird. Die Untersuchung von Enzymen verschiedener Spezies ergibt, dass die Länge der effektiv umgesetzten Substrate und die strukturelle Grundlage für die Substrat-Präferenz speziesunabhängig konserviert sind. Die Präferenz für gecappte Mono- und Dinukleotide von DcpS stimmt mit unseren vorläufigen Daten für die Länge der Exosom-Produkte überein. Daraus schließen wir, dass die biologische Funktion der Beschränkung von DcpS auf kurze Substrate auf einer direkten Übergabe von RNA-Fragmenten von Exosom zu DcpS beruht. Dies verhindert, dass von Transkripten, welche aktiv translatiert werden, die Cap-Struktur durch DcpS entfernt wird.