Vollsynthetische Rekonstruktion eines Genclusters aus Bacillus cereus VD169 zur Produktion des Antibiotikums FR-900493

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dc.contributor.advisor Gust, Bertolt (PD Dr.)
dc.contributor.author Raichle, Tobias Otto Hermann
dc.date.accessioned 2019-08-14T07:07:37Z
dc.date.available 2019-08-14T07:07:37Z
dc.date.issued 2021-06-25
dc.identifier.uri http://hdl.handle.net/10900/91476
dc.identifier.uri http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-dspace-914763 de_DE
dc.identifier.uri http://dx.doi.org/10.15496/publikation-32857
dc.description.abstract Dissertation ist gesperrt bis 25.06.2021. de_DE
dc.description.abstract Die Substanz FR-900493 zählt zu den Nukleosid-Antibiotika mit ADR-GlyU Grundstruktur, zu welchen auch die bekannteren Caprazamycine und Muraymycine gehören. Der Wirkmechanismus all dieser Substanzen besteht in der Hemmung der MraY-Translokase, einem Enzym, das einen essentiellen Zwischenschritt im Rahmen der Peptidoglykan-Biosynthese katalysiert. FR-900493 wurde erstmalig im Jahr 1989 aus Kulturen des Stammes Bacillus cereus No. 2045 isoliert. Hierbei konnten antibakterielle Eigenschaften gegen Staphylococcus aureus und Bacillus subtilis nachgewiesen werden. Obwohl die biosynthetischen Gencluster aller anderen Nukleosid-Antibiotika bereits identifiziert und beschrieben wurden, ist dies für FR-900493 bis heute nicht der Fall. Zudem ist die Genomsequenz des Produzentenstammes in den öffentlichen Datenbanken bisher nicht hinterlegt. Diese Arbeit beschreibt erstmalig ein Gencluster, das zur Produktion dieser noch wenig erforschten Substanz befähigt. Es wurde mittels „Genome Mining“ in der Genomsequenz von Bacillus cereus VD169 entdeckt, welcher aufgrund eines ebenfalls vorhandenen Virulenzplasmides für nähere Untersuchungen jedoch nicht zur Verfügung stand. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher das ~25 kb umfassende Gencluster aus 45 künstlichen Einzelfragmenten vollsynthetisch rekonstruiert. Während dieses Gesamtprozesses kamen verschiedene Methoden der synthetischen Biologie zum Einsatz. Der sukzessive Aufbau erfolgte hierbei unter Anwendung der in vitro Methode des Gibson-Assembly. Um Sequenzfehler auszuschließen, wurde die Integrität der Zwischenstufen durch zahlreiche Sequenzierungen kontinuierlich überprüft. Nach erfolgreicher Rekonstruktion wurde das Gencluster in den heterologen Produzenten Bacillus subtilis 168 integriert. Allerdings zeigte sich zunächst keine Produktion neuer Sekundärmetaboliten. Eine Analyse mittels RT-PCR ergab, dass Teile des rekonstruierten Genclusters noch transkriptionell inaktiv waren. Daher wurden zur Aktivierung dieses stillen Genclusters zwei synthetische Hilfskonstrukte integriert, um damit konstitutiv aktive Promotoren einzubringen. Eine weitere Betrachtung der Transkription mittels RT-PCR bestätigte den Erfolg dieser Strategie. Nach erneuter Transformation des nun aktivierten Genclusters in Bacillus subtilis 168 resultierten schließlich mehrere Transformanten, die tatsächlich das Nukleosid-Antibiotikum FR-900493 sowie weitere biosynthetische Intermediate produzierten. de_DE
dc.language.iso de de_DE
dc.publisher Universität Tübingen de_DE
dc.rights ubt-podno de_DE
dc.rights.uri http://tobias-lib.uni-tuebingen.de/doku/lic_ohne_pod.php?la=de de_DE
dc.rights.uri http://tobias-lib.uni-tuebingen.de/doku/lic_ohne_pod.php?la=en en
dc.subject.classification Antibiotikum , Naturstoff , Synthetische Biologie , Gencluster , Bacillus de_DE
dc.subject.ddc 500 de_DE
dc.subject.ddc 540 de_DE
dc.subject.ddc 570 de_DE
dc.subject.other Nukleosid-Antibiotikum de_DE
dc.subject.other Genome Mining de_DE
dc.subject.other Gibson-Assembly de_DE
dc.title Vollsynthetische Rekonstruktion eines Genclusters aus Bacillus cereus VD169 zur Produktion des Antibiotikums FR-900493 de_DE
dc.type Dissertation de_DE
dcterms.dateAccepted 2019-06-25
utue.publikation.fachbereich Pharmazie de_DE
utue.publikation.fakultaet 7 Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät de_DE
utue.publikation.noppn yes de_DE

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