Influence of cGMP signaling on VSMC growth and its dependence on fibronectin in cultured VSMCs and development of atherosclerosis

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URI: http://hdl.handle.net/10900/91054
http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-dspace-910548
http://dx.doi.org/10.15496/publikation-32435
Dokumentart: Dissertation
Date: 2021-06-28
Language: English
Faculty: 7 Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Department: Biochemie
Advisor: Feil, Robert (Prof. Dr.)
Day of Oral Examination: 2019-06-28
DDC Classifikation: 500 - Natural sciences and mathematics
Other Keywords: VSMCs
cGMP
Atherosklerose
atherosclerosis
License: Publishing license excluding print on demand
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Inhaltszusammenfassung:

 
Dissertation ist gesperrt bis 28. Juni 2021 !
 
Der im Jahr 1963 erstmals beschriebene sekundäre Botenstoff cyclisches Guanosin 3´ 5´-Monophosphat (cGMP) ist ein intrazelluläres Signalmolekül mit vielen Funktionen. Zu den bekanntesten physiologischen Wirkungen von cGMP gehört die Regulation des Blutflusses durch die Relaxation der vaskulären Glattmuskelzellen (VSMCs). cGMP-modulierende Medikamente werden bereits seit mehr als einem Jahrhundert für die Behandlung vasokonstriktiver Erkrankungen verwendet. In Säugetieren erfolgt die Bildung von cGMP entweder durch (1) cytosolische Stickstoffmonoxid (NO)-sensitive Guanylyl-Cyclasen (NO-GCs) oder durch (2) transmembrane “partikuläre“ Guanylyl-Cyclasen (pGCs). Letztere werden u.a. infolge der Bindung natriuretischer Peptide wie atriales natriuretisches Peptid (ANP) oder C-Typ natriuretisches Peptid (CNP) aktiviert. In VSMCs werden viele Effekte von cGMP durch die cGMP-abhängige Proteinkinase Typ I (cGKI) vermittelt. Neben der Regulation des Gefäßtonus sind VSMCs auch am vaskulären Umbau im Rahmen kardiovaskulärer Erkrankungen wie Atherosklerose und Restenose beteiligt. Unter physiologischen Bedingungen zeigen VSMCs meist einen kontraktilen Phänotyp. Bei pathophysiologischen Veränderungen wechseln VSMCs jedoch verstärkt in einen sog. synthetischen Phänotyp. Dieser unterscheidet sich vom kontraktilen Phänotyp durch eine gesteigerte Sekretion extrazellulärer Matrix (ECM)-Proteine, den Verlust kontraktiler Markerproteine, sowie eine erhöhte Proliferation. Ob eine Aktivierung des cGMP-Signalwegs den Vorgang der phänotypischen Modulation von VSMCs fördert oder inhibiert und somit die Entstehung vaskulärer Erkrankungen beschleunigt oder verlangsamt, wird kontrovers diskutiert. Bisherige Studien mit Knockout-Mausmodellen verschiedener Komponenten des cGMP-Signalweges weisen auf eine pro-atherosklerotische Wirkung des Signalweges in VSMCs hin. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde der Effekt von cGMP auf das Wachstum von primären VSMCs untersucht. Anders als in vorhergehenden Wachstumsuntersuchungen, deren Ergebnisse auf konventionellen Endpunktmessungen (WST, MTS) beruhten, wurde in dieser Arbeit eine neue Impedanz-basierte Messtechnik mit der Bezeichnung xCELLigence verwendet. Diese Methode ermöglichte es, das Wachstumsverhalten von VSMCs in Echtzeit zu verfolgen und somit ein besseres Verständnis der Wachstumsregulation über den cGMP-Signalweg zu erhalten. Durch den Vergleich von Wildtyp-VSMCs mit NO-GC- und cGKI-defizienten VSMCs konnte gezeigt werden, dass NO (75 µM DETA-NO) das Wachstum von VSMCs durch die Aktivierung der NO-GC-cGMP-cGKI Signalkaskade stark beschleunigt. 2 In der verwendeten Konzentration hatte NO keinen signifikanten Einfluss auf die Vitalität der Zellen. Im Gegensatz zu NO bewirkte die Stimulation mit ANP nur eine moderate Erhöhung der Wachstumsrate, hatte aber einen stark positiven Effekt auf die Vitalität der VSMCs. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass es in VSMCs unterschiedliche cGMP-Kompartimente gibt, nämlich NO-induziertes globales cGMP und durch ANP ausgelöste lokale cGMP-Signale, welche unterschiedliche Effekte auf Zellwachstum und Vitalität vermitteln. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass der cGMP-induzierte Wachstumseffekt am stärksten ist, wenn die Aktivierung des cGMP-Signalwegs direkt bei der Aussaat der Zellen erfolgt. Diese Beobachtung lässt darauf schließen, dass cGMP vor allem in frühen Phasen des Wachstums, insbesondere beim adhärieren der Zellen, eine wichtige Funktion hat. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde analysiert, welchen Einfluss das ECM-Protein Fibronektin (Fn) auf das Wachstumsverhalten und die phänotypische Modulation von VSMCs ausübt und ob es evtl. mit dem cGMP-Signalweg in Verbindung steht. cGMP-Messungen mit dem FRET-basierten cGMP-Sensor cGi500 zeigten, dass in Gegenwart von Fn gewachsene VSMCs stärker auf CNP als auf ANP reagieren. Mittels Immunfluoreszenz-Färbungen konnte gezeigt werden, dass Zellen, die verstärkt auf CNP reagieren, eine reduzierte Expression kontraktiler Markerproteine (wie z.B. SMαA) haben und demzufolge einen eher synthetischen Phänotyp aufweisen. Schließlich wurde durch die Generierung eines Glattmuskel-spezifischen Fn Knockouts (Fn-smko) untersucht, inwiefern das Fn aus VSMCs die Entstehung von Atherosklerose beeinflusst. Interessanterweise wurde in VSMC-Kulturen aus Fn-smko Mäusen ein erhöhtes Zellwachstum beobachtet. Eine Western Blot-Analyse der Phosphorylierung von VASP (ein Indikator für die Aktivität von cGKI) sowie FRET-basierte cGMP-Messungen (Konzentrations-Wirkungs-Analyse von NO) wiesen darauf hin, dass VSMCs aus Fn-smko Mäusen eine erhöhte NO-GC Aktivität besitzen, was deren erhöhtes Zellwachstum erklären könnte. In Übereinstimmung mit den in vitro Daten zeigten in vivo Untersuchungen von Fn-smko Mäusen eine Zunahme atherosklerotischer Plaques. Diese Plaques waren im Vergleich zu Plaques aus der Fn-exprimierenden Kontrollgruppe durch eine höhere Stabilität (SMαA > Mac2 positive Fläche eines Plaques) gekennzeichnet. Zusammenfassend weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass die genetische Ablation von Fn in Glattmuskelzellen zu einer Amplifikation der wachstumsfördernden cGMP Signalkaskade in VSMCs führt, welche wiederum die Entwicklung stabiler atherosklerotischer Plaques mit einem hohen Anteil an VSMCs fördert.
 

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