Untersuchungen zur Immunregulation durch ECP-behandelte Monozyten in einem in vitro Modell

Abstract

Die Extrakorporale Photophorese (ECP) ist eine immunmodulatorische Therapie zur Behandlung von Patienten mit T-Zell vermittelten Erkrankungen und verschiedenen Autoimmunerkrankungen. Während der ECP werden Leukozyten des peripheren Blutes durch Leukapherese separiert, mit einem Photoaktivator (8-MOP) inkubiert sowie mit UV-A-Licht bestrahlt und anschließend dem Patienten reinfundiert. Der klinische Nutzen für ECP-Patienten wurde bereits in der Literatur beschrieben, dennoch konnte der Wirkmechanismus der ECP-Behandlung noch nicht vollständig geklärt werden. Insbesondere ist in der Literatur die Funktion der Monozyten limitiert und kontrovers. In der vorliegenden Arbeit sollte daher ein in vitro ECP-Modell etabliert werden, anhand dessen der immunregulatorische Effekt ECP-behandelter Monozyten gesunder Spender auf co-kultivierte T-Zellen und die Monozyten selbst untersucht werden kann. Bisherige Arbeiten haben bereits gezeigt, dass Dendritische Zellen (DCs) des Photophoreseprodukts von ECP-Patienten keine T-Zellproliferation induzieren können. Weitere Studien berichten von einer Verlagerung der Th1- und Th2-Immunantwort abhängig von der behandelten Indikation. Der immunmodulatorische Effekt ECP-behandelter Monozyten konnte in der hier vorliegenden Arbeit durch eine signifikante Abnahme der Proliferationsfähigkeit von co-kultivierten T-Zellen und signifikante Induktion proinflammatorischer Th1-Zellen, Th17-Th1-Zellen und IL-2+ T-Zellen gezeigt werden, während antiinflammatorische Th2-Zellen anteilsmäßig unbeeinflusst blieben. Für diese Effekte war ein Zellkontakt zwischen T-Zellen und ECP-behandelten Monozyten notwendig. Des Weiteren konnten CD14+ Monozyten in der vorliegenden Arbeit als wichtige Mediatoren der ECP-induzierten Effekte auf T-Zellen identifiziert werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Abnahme der CD14+ Zellen nach ECP nicht als alleinige Ursache der auf T-Zellen ausgeübten Effekte bestimmt werden kann. Vielmehr deutete der signifikante Anstieg der CD14+CD209-HLA-DR+CD86+ Monozyten und CD14+CD209+HLA-DR+CD86+ Makrophagen auf eine Veränderung hinsichtlich des Aktivierungszustandes der in vitro ECP-behandelten Monozyten hin. Die in der Literatur beschriebene Induktion von DCs sowie eine Zunahme an myeloiden Suppressorzellen (Englisch: myeloid-derived suppressor cells, MDSCs) konnte in der hier vorliegenden Arbeit nicht bestätigt werden. Zudem spielten durch ECP-induzierte Makrophagen des M2-Phänotyps keine Rolle für die Abnahme der T-Zellproliferation im in vitro ECP-Modell, sondern schienen vielmehr diese zu stimulieren. Durch die Identifizierung von Kontrollstellen und Schlüsselgenen der Immunregulation sollte überprüft werden, wie die ECP-behandelten Monozyten die zuvor beschriebenen Effekte auf co-kultivierte T-Zellen ausüben können. Aus der Literatur ist bekannt, dass Interaktionen des immunmodulatorischen Checkpoints PD-L1 mit PD-1 einen Zellzyklusarrest in der G0/G1 Phase hervorrufen und PD-L2-PD-1 Interaktionen die T-Zellrezeptor vermittelte Proliferation inhibieren können. Während eine ECP-Behandlung von Monozyten in der vorliegenden Arbeit keine bzw. sehr geringe Anteile an PD-L2+ Monozyten bzw. T-Zellen induzierte, konnten verstärkt PD-L1+ Monozyten nach ECP nachgewiesen werden. Eine Blockade der PD-L1-PD-1 Achse führte zu einer nur teilweisen Wiederherstellung der T-Zellproliferation im in vitro ECP-Modell, was auf einen multifaktoriellen Wirkmechanismus der ECP hindeutet. Dabei konnte IDO als potentiell additiver Modulator der T-Zellproliferation bei ECP identifiziert werden. Umfangreiche Transkriptomanalysen ECP-behandelter Monozyten mittels Next-generation-sequencing identifizierten in der vorliegenden Arbeit potentielle Gene für die Klärung offener Fragestellungen in Bezug auf den Mechanismus der ECP und zur Unterstützung der bisherigen Ergebnisse. Die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse sowie die Übereinstimmung des in vitro ECP-Modells mit ex vivo ECP-behandeltem Patientenmaterial und in vitro ECP-behandelte Monozyten von Patienten konnte hinsichtlich des Einflusses auf die Proliferationsfähigkeit und Zelltypenanteile von T-Zellen verifiziert werden. Die ECP-Behandlung wird häufig als second-line treatment angewendet, wie beispielsweise bei GvHD-Patienten. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der macrophage migration inhibitory factor (MIF) in in vitro ECP-behandelten Monozyten herunterreguliert ist, welches laut Literatur an der Entwicklung einer Glucocorticoidresistenz von GvHD-Patienten beteiligt sein kann. Zur Verstärkung des immunregulatorischen Effekts der ECP können GvHD-Patienten mit Vitamin D3 behandelt werden. Eine in vitro Kombinationstherapie aus 1α,25-(OH)2D3 Stimulation und ECP der Monozyten führte zu einer signifikanten Abnahme der T-Zellproliferation, sowie zu einem niedrigeren Niveau an proinflammatorischen T-Zelltypen und einem leichten Anstieg an antiinflammatorischen Th2-Zellen im in vitro ECP-Modell. Eine Untersuchung immunologischer Fragestellungen mit Hilfe des in dieser Arbeit etablierten in vitro ECP-Modells ermöglicht es unabhängig von möglichen Limitationen bei der Verwendung von Patientenmaterial, wie z.B. Diagnose der Erkrankung, Vorbehandlungen der Patienten und Zugang zu Patientenproben und ECP-Zentren, zur weiteren Aufklärung des Wirkmechanismus der ECP beitragen zu können. Durch fortführende Analysen sowie eine Erweiterung des in vitro ECP-Modells um weitere Zelltypen, könnte zukünftig eine Optimierung der ECP für den klinischen Einsatz erfolgen.