Identifizierung und Charakterisierung von „NON-PHOTOTROPIC HYPOCOTYL 3“ als neuartiger Interaktionspartner pflanzlicher 14-3-3 Proteine

Abstract

14-3-3 Proteine sind eukaryotische Proteine, die sequenzspezifisch und phosphorylierungsabhängig mit zahlreichen anderen Proteinen interagieren. Hierdurch modifizieren sie die Aktivität, Lokalisation oder Interaktionsfähigkeit ihrer „Targets“ und sind somit an der Regulation diverser physiologischer Prozesse beteiligt. – Mittels eines Y2H-„Screens“, in dem die 14-3-3 Isoform epsilon als Köder verwendet wurde, wurde eine große Anzahl von putativen Interaktionspartnern (IPs) identifiziert. Zahlreiche Proteine erwiesen sich als neue putative „Targets“; dazu gehörten fünf Mitglieder der „NPH3/RPT2-Like“-Protein-Familie (NRLs), die bei phototropen Signaltransduktions-Ereignissen und Entwicklungs-Prozessen entscheidende Rollen spielen. In Bezug auf die prominentesten Mitglieder der NRL-Familie „NON-PHOTOTROPIC HYPOCOTYL 3“ (NPH3), „ROOT PHOTOTROPISM 2“ (RPT2) und „ENHANCER OF PINOID“ (ENP) wurde die 14-3-3 Interaktion bestätigt und ein 14-3-3 Bindemotiv identifiziert (Y2H). – Die NPH3/14-3-3 Interaktion wurde über FRET-FLIM und rBiFC in transient-transformierten N. benthamiana-Blättern, die fluoreszenzmarkierte Proteine exprimierten, verifiziert. Die Mutation des Bindemotivs (NPH3*) führte zu einer signifikant reduzierten Assoziation von 14-3-3. – CLSM-Studien zeigten, dass sowohl NPH3 als auch NPH3* in transient-transformierten Arabidopsis-Protoplasten und Tabak-Blättern nahe an oder mit der Plasmamembran (PM) assoziiert sind; eine Variation von homogener Verteilung, über abgegrenzte großflächige „Cluster“, bis hin zu distinkt punktförmigen Mustern entlang der PM war ersichtlich. Sowohl C- als auch N-terminale NPH3-Deletions-Proteine lokalisierten hingegen in globulären Strukturen im Zytoplasma. – Um die physiologische Relevanz der NPH3/14-3-3 Interaktion zu analysieren, wurden NPH3 und NPH3* stabil in einer nph3-„loss-of-function“-Linie exprimiert, die keine phototrope Reaktion aufweist. Im Gegensatz zu NPH3, war das mutierte Protein nicht in der Lage, die phototrope Reaktivität vollständig zu komplementieren. Demzufolge scheint die NPH3/14-3-3 Interaktion für bestimmte NPH3-vermittelte BL-Reaktionen physiologisch von Bedeutung zu sein. – Zusätzlich wurde die Wirkung der BL-Behandlung auf Hypokotyle von etiolierten Keimlingen, die ektopisch NPH3-mGFP4 exprimieren, analysiert. Bemerkenswerterweise führte die Exposition mit Licht zur Internalisierung des PM-lokalisierten NPH3s, das anschließend zytoplasmatische Granula ausbildete. – Eine Kolokalisation von NPH3 und FM® 4-64 (Endozytose-Tracer) nach Brefeldin A (BFA)-Applikation in BFA-Kompartimenten konnte nicht beobachtet werden, was vermuten lässt, dass die Internalisierung nicht von der Clathrin-vermittelten Endozytose abhängt. – Eine Veränderung der subzellulären Lokalisation bei der Irradiation von Hypokotylen, die NPH3* exprimieren, war erstaunlicherweise nicht ersichtlich. Dies deutet darauf hin, dass die 14-3-3 Interaktion für die lichtinduzierte Internalisierung und die Funktion von NPH3 von Bedeutung ist.