Entwicklung einer neuartigen messengerRNA (mRNA)- basierten Therapiestrategie zur Optimierung der Wundheilung

Abstract

Da herkömmliche Therapien der Wundheilung nur noch wenig optimierbar sind, zielt ein neuer Therapieansatz auf das Einschleusen von spezifischer messengerRNA in Zellen ab, um so den Wundprozess zu beeinflussen bzw. sogar zu beschleunigen. Der Wachstumsfaktor KGF (keratinocyte-growth factor) verspricht hierbei viel Potential in sich zu tragen, da er großen Einfluss auf Keratinozyten und somit auf die Reepithelialisierung von Wunden hat. In der vorliegenden Dissertation wurden deshalb Zellen mit mRNA, welche den Wachstumsfaktor KGF kodiert, transfiziert. Dafür wurden sowohl Zelllinien, als auch primäre Keratinozyten ausgewählt. Zunächst wurde die Effizienz der Transfektion durch Testung verschiedener Transfektionsreagenzien erhöht bzw. versucht die immunologische Reaktion der Zellen zu verringern. Hierzu wurde zur Kontrolle eGFP mRNA transfiziert, um die mRNA Aufnahme und Translation in den Zellen zu überprüfen. Das eGFP Protein konnte nach erfolgreicher Transfektion und Translation mittels Fluoreszenzmikroskopie überprüft werden. Nach Transfektionsende wurde die Viabilität der Zellen untersucht. Da der menschliche Organismus jedoch deutlich komplexer als die zweidimensionale Kultivierung von Zellen ist, wurde im nächsten Schritt ein einfaches dreidimensionales Hautmodell hergestellt. Dazu wurden sogenannte Zell-Sphäroide mittels der Hanging drop Methode hergestellt und schließlich mit eGFP mRNA transfiziert. Ziel dieses Experiments war es, die Transfektion in dreidimensionaler Zellkultur zu untersuchen. Hierbei zeigte sich, dass auch Zellen in tiefen Schichten des Sphäroids erfolgreich transfiziert wurden, bzw. das eGFP Protein herstellten. In den weiteren Experimenten wurde die Transfektion von KGF/eGFP mRNA an im Labor isolierten humanen Keratinozyten untersucht, da die mRNA Transfektion in die Zielzellen zusätzlich optimiert werden muss. Außerdem sollten weitere Transfektionsversuche an humaner, bzw. porciner Haut durchgeführt werden. Nach Optimierung der Transfektion gelang es über die Applikation der zu transfizierenden mRNA über Nadeln in das Gewebe, dass die Zellen der Haut erfolgreich eGFP bildeten. Ebenso wurde KGF mRNA transfiziert, wobei jedoch mittels ELISA kein KGF Protein nachgewiesen werden konnte. Über die Herstellung von Gefrierschnitten, welche besonders schonend für die translatierten Proteine sind, konnte das eGFP Protein schließlich unter dem Konfokalmikroskop sichtbar gemacht werden. Schlussendlich konnte gezeigt werden, dass primäre Keratinozyten erfolgreich mit KGF mRNA transfizierbar sind und sowohl die einfachen dreidimensionalen Hautmodelle, als auch die ex-vivo Hautmodelle erfolgreich das eGFP Protein nach Transfektion exprimierten. Bis die KGF mRNA in der Wundheilungstherapie jedoch zum Einsatz kommen kann, muss noch weitere Forschungsarbeit geleistet werden. Trotzdem scheint diese Therapiestrategie zukünftig viel Potential in sich zu tragen.