Harnessing endogenous human ADARs for RNA repair

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URI: http://hdl.handle.net/10900/89731
http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-dspace-897315
http://dx.doi.org/10.15496/publikation-31112
Dokumentart: Dissertation
Date: 2021-02-26
Language: English
Faculty: 7 Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Department: Biochemie
Advisor: Stafforst, Thorsten (Prof. Dr.)
Day of Oral Examination: 2019-06-04
DDC Classifikation: 500 - Natural sciences and mathematics
Other Keywords: ADAR
Editierung
Punkt Mutation
Nonsense Mutation
CRISPR
RNAi
Mitophagy
Antisense Oligonukleotid
R/G Motif
RESTORE
Inosine
Site Directed RNA Editing
Transcript Repair
Point Mutation
Deaminase
A-to-I RNA Editing
License: Publishing license including print on demand
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Inhaltszusammenfassung:

 
Dissertation ist gesperrt bis 26.Februar 2021 !
 
Gerichtete A-nach-I RNA-Editierung ist ein neues Transkriptom-Manipulationsverfahren, das die Desaminierung ausgewählter Adenosine und damit deren Umwandlung zu Inosin ermöglicht. Da Inosin während der Transkription und Translation als Guanosin erkannt wird, können mit dieser Methode genetische Informationen auf der RNA-Ebene bearbeitet werden. Im Grunde fügt das Verfahren also ge-zielt A-nach-G Punktmutationen in mRNAs ein und erlaubt damit die Umcodierung von Start- und Stopp-Codons, Spleißstellen, miRNA-Bindestellen, sowie 12 der 20 kanonischen Aminosäuren. Hierdurch wird eine Vielzahl an Eingriffen möglich, wie die Korrektur von G-nach-A Punktmutationen, die Manipulation von Proteinfunktionen durch Änderung relevanter Aminosäuren, oder die Modulation zellulärer Signal-kaskaden. Das von uns entwickelte R/G guideRNA System dirigiert humanes Wildtyp-ADAR (adenosine deaminase acting on RNA) zu bestimmten Ziel-Adenosinen in ausgewählten mRNAs. Durch sukzessives rationales Design wurde im Zuge dieser Arbeit, ein genetisch codierbares R/G gRNA Design entwickelt, das es erstmals erlaubt endogenes humanes ADAR zu rekrutieren. Im Gegensatz zu allen anderen gegenwärtig verfügbaren gerichteten RNA-Editierungsverfahren, ist es daher nicht auf die Überexpression einer Editase angewiesen. Hierdurch kann nun genetische Information auf Ebene des Transkriptoms durch simples Verabreichen kurzer Plasmid- oder Adenovirus-codierter guideRNAs manipuliert werden. Zusätzlich konnten in dieser Arbeit grundlegende Fragen beantwortet werden, die der Weiterentwicklung von gerichteter RNA-Editierung zu einer therapeutischen Anwendung vorangehen mussten. Es konnte erstmals gezeigt werden, dass durch das R/G gRNA-System auch die Editierung endogener mRNAs möglich ist. Des Weiteren wurde die rezessive PINK1-W437X-Amber Funktionsverlustmutation in HeLa Zellen korrigiert. Das Verfahren erlaubte es hierbei, die Funktion des durch die genannte Mutation gestörten PINK1-Parkin-vermittelten Mitophagie-Signalwegs, welcher mit der Ätiologie der Parkinsonkrankheit verknüpft ist, wiederherzustellen. Unsere R/G gRNAs haben das Potential als völlig neue Generation von Medikamenten beispielsweise für die Behandlung von Punktmutationen oder therapeutische Regulierung von Proteinfunktionen eingesetzt zu werden. Hierbei würden bestehende Ansätze zur Genom- und Transkriptom-Manipulation durch bisher undurchführbare Eingriffe auf RNA-Ebene ergänzt.
 

Abstract:

Site‐directed adenosine-to-inosine (A-to-I) RNA editing is a novel transcriptome engineering approach that allows to recode genetic information at RNA level by specific deamination of adenosines. Because the resulting inosine is read as guanosine by cellular machines and during translation, site-directed RNA editing (SDRE) does ultimately introduce A-to-G base substitutions into mRNAs. This opens up the opportunity to recode Start- and Stop-codons, splice signals, miRNA recognition sites, and 12 of the 20 canonical amino acids. Thus SDRE allows a wide range of interventions, including the manipulation of residues relevant for signaling or protein function, and the ability to correct G-to-A point mutations. Our R/G guideRNA SDRE system allows to steer wild-type human ADAR (adenosine deaminase acting on RNA) enzymes towards selected target adenosines within user-defined mRNAs. The genetically encodable R/G gRNA design, which was developed during this thesis based on successive rounds of rational design, allows for the first time to recruit endogenous human ADAR enzymes. In contrast to all other SDRE approaches, the R/G gRNA system does therefore not require the overexpression of an editase. Transcriptome engineering can now be achieved by the simple application of a plasmid or adenovirus encoded short guideRNA. During this thesis, several fundamental questions, which had to precede the further development of SDRE into a therapeutic application, could be solved. The R/G gRNA system became the first SDRE approach to prove editing of endogenous mRNAs. In addition, it was used to recode the recessive PINK1 W437X amber loss-of-function mutation in HeLa cells and could show that SDRE allows the functional rescue of PINK1-Parkin-mediated mitophagy, which is linked to the etiology of Parkinson's disease. Our R/G gRNAs have high potential to become a next generation drug for the precise correction of disease-causing point mutations and the tuneable manipulation of protein function. In doing so, they would complement existing genome and transcriptome manipulation strategies by enabling interventions out of reach for currently available molecular tools.

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