D-Amino acid transport, metabolism, and its link to ethylene regulation in Arabidopsis thaliana

Abstract

The relevance of the homochirality of proteinogenic amino acids for life is undisputed, but a growing number of biological functions could be assigned to the non-proteogenic D-enantiomers. When it comes to D-AAs in plants, information was relatively scarce for a long time. Recently, it has been shown that D-AAs are taken up by plants from soil, but could also be synthesised de novo, and that D-AAs cause physiological e ects in plants. These were indications that D-AAs are responsible for a variety of yet poorly understood or even undiscovered functions in plants. For this reasons, I performed experiments to analyse transport, metabolism and functions of these molecules in Arabidopsis thaliana. Previously, it was shown that D-AAs are taken up and utilised by plants, but how the plant reduces excessive amounts of them still remained unclear. Analyses of plant D-AA content after D-Ala and D-Glu treatment, opened the question if exudation of D-AAs into the rhizosphere takes place, and whether it plays a role in the reduction of D-AA content in plants. Exudation of D-Ala and D-Glu could be confi rmed by AA analyses of growth media from seedlings treated with these D-AAs. Further tests revealed that other D-AAs are also secreted. Exudation experiments with transport inhibitors revealed that root exudation of D-AAs is rather passive and comparable to that of L-AAs, whereas uptake of D-AAs was found to be active. It was also found that plants are able to reduce their D-AA contents by means other than exudation, and therefore metabolic processes were postulated. Analyses of the D-AA speci c transaminase (AtDAT1) revealed that this enzyme is responsible for the metabolisation of the majority of tested D-AAs in Arabidopsis thaliana. The results of our biochemical experiments revealed that D-Met is the preferred substrate for this enzyme, with D-Ala as the major product. Furthermore, the loss of this enzyme led to a triple response and increased ethylene synthesis after D-Met treatment, indicating a functional relation between regulation of D-AA metabolism and plant development. These results show that AtDAT1 is a crucial enzyme in the D-AA metabolism in Arabidopsis thaliana and that these molecules have a relevant function in higher plants, contrary to what was communally accepted.

Die Bedeutung der Homochiralität proteinogener Aminosäuren ist unbestritten, jedoch konnte auch den nicht-proteinogenen D-Enantiomeren eine wachsende Anzahl biologischer Funktionen zugeordnet werden. Über die Rolle, die D-Aminos auren (D-AAs) in Pflanzen spielen, gibt es bislang relativ wenige Informationen. Kürzlich konnte gezeigt werden, dass Pflanzen D-AAs einerseits aus dem Boden aufnehmen, andererseits de novo synthetisieren k onnen und dass D-AAs physiologische Effekte in Pflanzen bewirken. Dies weist darauf hin, dass D-AAs für eine Vielzahl von Funktionen in Pflanzen verantwortlich sein können, die bislang wenig verstandenen oder sogar noch nicht beschrieben sind. Aus diesen Gründen habe ich Experimente durchgeführt, die den Transport, den Metabolismus und die Funktion dieser Moleküle in Arabidopsis thaliana analysieren. In vorherigen Untersuchungen wurde gezeigt, dass D-AAs aufgenommen und verwertet werden, aber wie Pflanzen überschüssige Mengen von D-AAs reduzieren, ist bislang unklar. Konzentrationsbestimmungen von D-AAs nach Verabreichung von D-Ala und D-Glu warfen die Frage auf, ob D-AAs in die Rhizosphere exsudiert werden und ob dieser Vorgang eine Rolle für die Konzentrationsabnahme innerhalb der Pflanze spielt. Bei Keimlingen in Flüssigkultur, die mit D-Ala und D-Glu behandelt wurden, konnten diese Aminosäuren im Außenmedium nachgewiesen werden, was eine Exsudation bestätigt. Weitere Experimente zeigten, dass auch andere D-AAs ins Medium sekretiert wurden. Experimente mit Transportinhibitoren zeigten, dass die Exsudation passiv erfolgt und vergleichbar mit der Exsudation von L-AAs ist, während die Aufnahme von D-AAs einen aktiven Vorgang darstellt. Pflanzen sind nicht nur in der Lage, die Konzentration von D-AAs durch Exsudation zu reduzieren, sondern können sie auch in metabolischen Prozessen verwenden. Die Analyse der D-AA-spezifischen Transaminase (AtDAT1) ergab, dass dieses Enzym für den größten Teil des Metabolismus der D-AAs in Arabidopsis zuständig ist. Unsere biochemische Charakterisierung von AtDAT1 ergab, dass D-Met das bevorzugte Substrat darstellt während D-Ala das Hauptprodukt ist. Ein Verlust der Enzymfunktion führt zu einer Triple Response und verstärkter Ethylen-Synthese nach D-Met-Behandlung, was auf eine funktionelle Verbindung zwischen der Regulation des D-AA-Metabolismus und der P anzenentwicklung hinweist. Diese Ergebnisse zeigen, dass AtDAT1 ein zentrales Enzym des D-AAMetabolismus in Arabidopsis ist und dass D-AAs, anders als bisher angenommen, eine wichtige Funktion in höheren Pflanzen ausüben.