Regulation of the carbon/nitrogen storage polymer cyanophycin by the signal transduction protein PII in Synechocystis sp. PCC 6803

Abstract

Cyanobacteria are one of the deepest branching bacterial phyla on earth. Today, cyanobacteria occupy almost all illuminated habitats, where they utilize various nitrogen sources. Nitrogen assimilation strictly depends on carbon and nitrogen availability and requires a fine-tuned regulatory network involving the PII signal transduction protein. In the present study I focused on the regulation of the carbon/nitrogen storage polymer cyanophycin by the PII signaling protein. Cyanophycin is a non-ribosomal synthesized polyamide consisting of arginine and aspartate. Cyanophycin accumulation depends on the arginine availability. PII controls the rate limiting step of arginine biosynthesis by regulating the key enzyme N-acetylglutamate kinase (NAGK). A PII variant with a single point mutation (I86N) was previously identified as a NAGK super activator in vitro. By introducing PII(I86N) in Synechocystis sp. PCC 6803, we created a strain which strongly overproduces cyanophycin up to 57 % of the cell dry mass. Since cyanophycin is a bio-polymer with high industrial interest, we performed several process optimization studies. During these studies, we observed that Synechocystis sp. PCC 6803 harboring the PII (I86N) variant showed impaired ammonium utilization. By analyzing this behavior, we could clarify that PII regulates ammonium uptake by interacting the with Amt1 ammonium permease. We could further demonstrate that PII mediates the light and ammonium dependent inhibition of nitrate uptake by interacting with the NrtC and NrtD subunits of the nitrate/nitrite transporter NrtABCD. During this study, we could also identify the UrtE subunit of the ABC-type urea transporter UrtABCDE as novel PII target. The interaction of PII with the UrtE subunit regulates the urea uptake in cyanobacteria. The occurrence of cyanophycin in cyanobacteria was known for more than 100 years; however, the biological function remained largely uninvestigated. During localization studies in Synechocystis sp. PCC 6803, we could show that the cyanophycin synthesizing enzyme CphA resides in an active and inactive state. When CphA was inactive, it localized diffusely in the cytoplasm. When cyanophycin synthesis was triggered, CphA first aggregated into foci and was later localized on the surface of the cyanophycin granules. During degradation, CphA dissociates from the granule surface. Under standard laboratory conditions, the ability to synthesize cyanophycin did not confer a fitness advantage, however with a fluctuating and limiting nitrogen supplementation in combination with day/night cycles, the accumulation of the polymer provides a clear fitness advantage. Furthermore cyanophycin acts as a temporary nitrogen storage which allows nitrogen assimilation during the night. The accumulated cyanophycin can be subsequently used as an internal nitrogen source during the day.

In der Domäne der Bakterien bilden die Cyanobakterien eine der ältesten Abteilungen und sind heute in nahezu allen lichtzuganglichen Habitaten angesiedelt. Cyanobakterien können eine Vielzahl organischer und anorganischer Stickstoffquellen verstoffwechseln, wobei die Stickstoffassimilation über die intrazellulare Kohlenstoff- und Stickstoffbalance reguliert wird. Das PII Signaltransduktions-Proteins erfüllt hierbei eine zentrale Rolle. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Regulation des Kohlenstoff-/Stickstoff- Speicherpolymers Cyanophycin durch das PII Protein. Cyanophycin ist ein nicht-ribosomal synthetisiertes Polyamid bestehend aus Arginin und Asparaginsäure. Die Akkumulation von Cyanophycin ist von der Argininverfügbarkeit abhängig. Das PII Protein reguliert die Argininbiosynthese durch die Interaktion mit der N-Acetylglutamat Kinase (NAGK), dem Schlüssel-Enzym der Argininbiosynthese. Vorangegangene Studien zeigten, dass eine Punktmutation (I86N) in PII die aktivierende Wirkung auf NAGK in vitro deutlich verstärkt. Folglich konnten wir durch das Einbringen dieser PII (I86N) Variante in Synechocystis sp. PCC 6803 einen Stamm kreieren, der eine erhebliche Überproduktion von Arginin und ein Cyanophycinanteil von bis zu 57 % zur Zelltrockenmasse aufwies. Da Cyanophycin von industriellem Interesse ist, wurden verschiedene Prozessoptimierungsstudien angefertigt. Im Zuge dieser Studien stellte sich heraus, dass die PII (I86N) Variante die Ammoniumverwertung von Synechocystis sp. PCC 6803 negativ beeinflusst. Bei näheren Untersuchungen zeigte sich, dass PII die Ammoniumaufnahme durch die Interaktion mit der Amt1 Ammoniumpermease reguliert. Wir konnten ebenfalls demonstrieren, dass PII die licht- und ammoniumabhängige Nitrataufnahme-Inhibition durch die Interaktion mit der NrtC und NrtD Untereinheit des Nitrit/Nitrat Transporter NrtABCD vermittelt. Darüber hinaus konnte nachgewiesen werden, dass PII mit der UrtE Untereinheit des ABC-Typ Urea Transporter UrtABCDE interagiert und hierdurch die Ureaaufnahme reguliert. Das Auftreten von Cyanophycin in Cyanobakterien wurde bereits vor mehr als 100 Jahren beschrieben, jedoch blieb bis heute dessen biologische Funktion ungeklärt. Lokalisationsstudien in Synechocystis sp. PCC 6803, bei denen das Cyanophycin synthetisierende Enzym CphA mit eGFP fusioniert wurde, ergaben, dass CphA eine aktive und inaktive Form aufweist. In seiner inaktiven Form ist CphA diffus im Zytoplasma verteilt. Wird die Cyanophycinakkumulation induziert, aggregiert CphA zunächst in Focis und ist später an der Oberflache der Cyanophycingranula lokalisiert. Während dem Abbau dissoziiert CphA von der Granulaoberfläche und geht wieder in die inaktive Form über. Überraschenderweise hatten Cyanophycin freien Zellen unter Standard-Laborbedingungen einen Wachstumsvorteil gegenüber dem Wild-Typ. Um die Situation eines natürlichen Habitats zu imitieren, kultivierten wir beide Stamme bei schwankender Stickstoffversorgung zusammen mit Tag/Nacht-Zyklen. Unter diesen Bedingungen hatten die Cyanophycin akkumulierenden Zellen einen klaren Vorteil. Darüber hinaus konnten wir vorweisen, dass Cyanophycin als temporarer Stickstoffspeicher dient, der die Stickstoffassimilation in der Nacht ermöglicht. In der Nacht akkumuliertes Cyanophycin kann während des Tages als Stickstoffquelle genutzt werden.