Der Einfluss von Carnosolsäure auf den programmierten Zelltod von Erythrozyten

Abstract

In dieser Studie sollte mittels in vitro Versuchen getestet werden, ob Carnosolsäure einen Einfluss auf den suizidalen Zelltod von Erythrozyten ausübt. Mittels verschiedener Versuche sollte geklärt werden, über welche Mechanismen Carnosolsäure die charakteristischen Merkmale der Eryptose auslöst. Hierfür wurden Phosphatidylserinexposition, Zellschrumpfung, intrazelluläre Kalziumkonzentration, ROS- und Ceramidebildung gemessen. Phosphatidylserinexposition und Zellschrumpfung wurden sowohl im kalziumhaltigen als auch im kalziumfreien Nährmedium untersucht. Des Weiteren wurde getestet, ob Carnosolsäure hämolytisch wirkt. Die Phosphatidylserinexposition wurde mithilfe von FITC-konjugiertem Annexin-V bestimmt. Carnosolsäure bewirkte sowohl in kalziumhaltiger, als auch in kalziumfreier Ringerlösung eine signifikant erhöhte Phosphatidylserinexposition, wobei dieser Effekt durch Kalziumentzug signifikant geschwächt wurde. Die Zellschrumpfung wurde durch die Änderung im Vorwärtsstreulicht untersucht. Sowohl im kalziumhaltigen, als auch im kalziumfreien Medium war die Wirkung von Carnosolsäure signifikant. Kalziumentzug führte hierbei zu keiner signifikanten Abschwächung des Effekts. Der signifikante Anstieg des intrazellulären Kalziums in den Erythrozyten nach Einwirkung von Carnosolsäure wurde am FACS Calibur mittels der Fluo-3-Fluoreszenz bestimmt. Die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies und somit die DCFDA-Fluoreszenz sank nach Inkubation der Erythrozyten mit Carnosolsäure. Um die Bildung von Ceramide nachzuweisen, wurden zwei unterschiedliche Antikörper verwendet und deren Fluoreszenz am FACS Calibur analysiert. Die Untersuchung zeigte eine signifikante Erhöhung der Ceramidebildung. Die Hämolyserate wurde durch photometrische Untersuchung des Hämoglobingehalts im Überstand ermittelt. Carnosolsäure steigerte die Hämolyse signifikant. Zusammenfassend zeigen die Versuche, dass Carnosolsäure pro-eryptotisch, aber auch hämolytisch wirkt und die Eryptose sowohl durch den kalziumabhängigen, als auch den ceramide-abhängigen Signalweg auslöst.