Roles of the putative RNA helicase HELZ in mRNA regulation

Abstract

The CCR4-NOT complex is a multi-subunit complex in eukaryotes involved in many aspects of mRNA regulation including transcription, translation and mRNA deadenylation. The putative helicase with a zinc finger, HELZ, was reported to interact with the scaffolding protein CNOT1 of the CCR4-NOT complex. In addition, HELZ was found to interact with RNA polymerase II, histone methyl transferases (SMYD2 and 3), the cytoplasmic polyA binding protein PABPC1 and the RNA helicase and translation repressor DDX6. Accordingly, HELZ is assumed to function in both transcription and translation regulation. HELZ is conserved in metazoans as part of the UPF1-like family of SF1 helicases. RNA helicases are the designated enzymes that re-organise and re-arrange RNA structure and RNA-protein interactions. Despite the potential nature of the protein as a helicase and its interesting interaction network, very little is known about HELZ in cytoplasmic mRNA regulation. In this thesis, I provide for the first time a comprehensive characterisation of different roles of HELZ in cytoplasmic mRNA regulation in human cells. I describe how HELZ recruits the CCR4-NOT complex to induce 5’-to-3’ mRNA decay and translational repression when it is bound to the 3’UTR of reporter mRNAs. My data reveal an intricate mode of interaction with HELZ containing several binding regions for the NOT module of the CCR4-NOT complex. Furthermore, by comparing RNA-Sequencing data of a HEK293T HELZ-null cell line versus the data of the wild type cell line, I identified several potential transcripts regulated by HELZ. Additionally, I provide evidence that the ATPase activity of the helicase domain of HELZ is relevant in cells, and I uncover a novel role for HELZ as a possible regulator of 3’polyA tail regulation. 3’polyA tails of eukaryotic mRNAs are known to be dynamic and to determine the stability and translational efficiency of mRNAs. Interestingly, the expression of an ATPase-inactive HELZ mutant causes a general elongation of the length of the 3’polyA tail of mRNAs. In summary, my thesis describes previously unidentified roles of HELZ in mRNA metabolism and a list of potential transcripts targeted by HELZ. Altogether, HELZ could contribute to the regulation of gene expression at multiple levels: transcription, mRNA processing, translation and mRNA decay.

Der eukaryotische CCR4-NOT Komplex, ist ein Multi-Proteinkomplex, der sich aus mehreren Teilkomplexen zusammensetzt. Er reguliert viele Aspekte des mRNA Metabolismus, wie zum Beispiel die Transkription, die Translation und die Deadenylierung von mRNAs. Eine meiner Arbeit vorangegangene Studie zeigte, dass die mutmaßliche ‚Helikase mit Zink-Finger‘ (HELZ) mit dem Gerüstprotein CNOT1 des CCR4-NOT Komplexes interagiert. Außerdem wurde HELZ in Interaktion mit folgenden Proteinen gefunden: der RNA Polymerase II, den Histon-Methyltransferasen SMYD2 und SMYD3, dem zytoplasmatischem Poly(A)-Bindeprotein PABPC1 und mit dem Translations-Inhibitor DDX6. Daher geht man davon aus, dass HELZ eine Rolle bei der Transkription und der Translation von mRNAs spielt. HELZ ist innerhalb der Gruppe der Metazoa konserviert, und wird der UPF1- Familie der SF1 Helikasen zugeordnet. RNA-Helikasen können RNA-Sekundärstrukturen und RNA-Protein Bindungen umstrukturieren bzw. reorganisieren. Trotz der potentiellen Eigenschaft des Proteins als Helikase und seiner interessanten Interaktion mit anderen Proteinen, ist sehr wenig bekannt über die Rolle von HELZ in der zytoplasmatischen mRNA Regularion. Im Rahmen meiner Doktorarbeit führe ich erstmalig eine umfassende Charakterisierung der unterschiedlichen Rollen von HELZ im Bereich der mRNA Regulation im Menschen durch. Ich zeige wie HELZ, wenn es an die 3’UTR einer Reporter mRNA gebunden ist, den CCR4-NOT Komplex rekrutiert und dadurch den Abbau der mRNA vom 5‘- zum 3‘- Ende initiiert. Dabei weisen meine Daten auf ein komplexes Interaktionsmuster mit mehreren Bindestellen zwischen HELZ und dem NOT-Modul-Teilkomplex des CCR4-NOT Komplexes hin. Weiterhin gelang es mir, durch vergleichende Transkriptom-Analyse von HELZ-Null und Wild-Typ Zellen mehrere potentiell von HELZ regulierte mRNA Transkripte zu identifizieren. Zusätzlich konnte ich beweisen, dass die ATPase Aktivität, die sich in der Helikase Domäne von HELZ befindet, eine wichtige Rolle spielt und ich habe herausgefunden neu, dass HELZ als möglicher Regulator bei der Längen-Regulation des 3’-Poly(A)-Schwanzes fungiert. Es ist bekannt, dass der 3’-Poly(A)-Schwanz von eukaryotischen mRNAs sehr dynamisch ist und sowohl die Stabilität als auch die Translations Effizienz von mRNAs beeinflußt. Interessanterweise resultierte die Expression einer katalytisch inaktiven HELZ-Mutante in einer generellen Zunahme der mRNA 3’-Poly(A)-Schwanz Länge. Zusammenfassend beschreiben meine Studien bisher unbekannte Funktionen von HELZ im mRNA-Stoffwechsel und listen mögliche, von HELZ beeinflusste, Transkripte auf. Also kann HELZ dazu beitragen die Genexpression auf mehreren Ebenen zu beeinflussen: auf Ebene der Transkription, der mRNA-Prozessierung, der Translation und über den Abbau der mRNA.