Verbesserung der metabolischen Funktion der hepatischen Zelllinien HepG2, Huh7, HLE und AKN1 mittels 5-Azacytidin und Vitamin C

Abstract

Goldstandard zur Erforschung des Arzneimittelmetabolismus ist der primäre humane Hepatozyt, wobei aufgrund von Spenderknappheit eine optimale Alternative wünschenswert ist. In dieser Arbeit wurden vier Zelllinien (HepG2, Huh7, HLE und AKN1) untersucht, deren Zellmetabolismus mithilfe der epigenetischen Modifikatoren 5-Azacytidin und Vitamin C verbessert werden sollte. Die Stimulation der Zellen erfolgte für 48 Stunden in vier Ansätzen, d.h. unbehandelte Zellen als Kontrolle sowie Inkubation mit 20 µM 5-Azacytidin oder 1 mM Vitamin C-2-Phosphat oder einer Kombination aus 10 µM 5-Azacytidin mit 0,5 mM Vitamin C-2-Phosphat. Es wurden repräsentative Marker für Zellfunktionen im Sinne der Exkretion (Biotransformation und Harnstoffzyklus), Synthese (Albumin) und Zellviabilität in Hepatozyten ausgewählt. Anhand etablierter Methoden wurden Ergebnisse zum einen auf der Ebene der Aktivität für die Exkretionsfunktionen (fluorometrische Substanzumwandlung für Enzyme der Biotransformation und Absorptionsmessung für die Harnstoffproduktion) bzw. durch Nachweis von vorhandenem Protein für die Synthesefunktion (Albumin-ELISA mit Lumineszenzdetektion) gesammelt und zum anderen auf Ebene der Genexpression eine Analyse der mRNA (semiquantitative PCR) durchgeführt. Informationen zur Zellviabilität wurden mittels Mikroskopie, Resazurinkonversion und LDH-Messung erlangt. Zusätzlich zur Beurteilung der metabolischen Veränderungen wurden Veränderungen der Genexpression für die DNA-Methyltransferasen nach epigenetischer Modifikation mithilfe von semiquantitativer PCR bestimmt, da die Grundlage dieser Forschungsarbeit auf einer Erhöhung eben dieser Enzyme basierte. Hierfür wurde zunächst eine real-time-PCR mithilfe des „Chromatinarray für Epigenetik-modifizierende Enzyme“ durchgeführt. Es zeigte sich in allen unbehandelten Zelllinien ein verändertes Expressionsmuster der DNA-Methyltransferasen 1, 3A und 3B. In dieser Arbeit konnten keine signifikanten Änderungen derselben auf Ebene des mRNA-Gehalts nach 48-stündiger epigenetischer Modifikation durch Azacytidin oder Vitamin C nachgewiesen werden. 5-Azacytidinbehandlung alleine zeigte im Hinblick auf die Zellviabilität eine Verminderung des Wachstums bei erhöhter Toxizität. Die Kombination von Azacytidin und Vitamin C-2-Phosphat zeigte diskret schwächere Auswirkungen (ohne statistisch relevanten Unterschied zu alleiniger Azacytidinstimulation). Ergebnisse der Stimulation mit Vitamin C-2-Phosphat alleine waren nicht in allen Zelllinien einheitlich. Beide Substanzen zeigten Potential für eine zukünftige Therapieoption für Patienten mit hepatozellulären Karzinomen. In dieser Arbeit wurden vereinzelt relevante Einflüsse von epigenetischer Stimulation auf die Enzymaktivität der Phase I- und II-Enzyme ohne statistisch signifikante Unterschiede in der Genexpression für verschiedene Zelllinien nachgewiesen. Ausgehend von den Ergebnissen dieser Arbeit zeigte allerdings die Zelllinie HepG2 nach 48-stündiger Modifikation durch 20 µM 5-Azacytidin das größte Potential zur weiteren Verbesserungen in Hinblick auf die Enzyme der Biotransformation. Die Harnstoffproduktion ließ sich in allen getesteten Zelllinien mithilfe von Azacytidinstimulation steigern. Wohingegen deutliche Unterschiede in der Genexpression der Enzyme des Harnstoffzyklus in den verschiedenen Zelllinien beschrieben werden konnten (ohne statistische Relevanz). Insbesondere für AKN1 und Huh7 Zellen wurden hohe Harnstoffproduktionen nach Azacytidinstimulation nachgewiesen. Sie könnten daher eine interessante Perspektive für Leberersatzverfahren darstellen. Albuminsekretion kann nur in Huh7 Zellen nachgewiesen werden, wohingegen nur in HepG2 Zellen eine signifikante Steigerung der Albumingenexpression durch Stimulation mit 20 µM 5-Azacytidin gezeigt werden konnte. Zusammenfassend ist zu sagen, dass mittels des hier durchgeführten Stimulationsprotokolls keine der Zelllinien einen idealen Ersatz für primären humanen Hepatozyten in präklinischen Untersuchungen liefern konnte. Die charakteristische Zusammensetzung des Enzymhaushaltes konnte nicht wiedererlangt werden. Es ist zu hoffen, dass weitere Forschungen unter anderem im Bereich der Epigenetik innovative Möglichkeiten im Hinblick auf präklinische Arzneimitteltests sowie Therapiemöglichkeiten für Leberkarzinome und Leberversagen liefern.