Identification of a cGMP/Ca2+ crosstalk in cerebellar granule neurons and development of a new method for cell-specific NO generation

Abstract

Stickstoffmonoxid (NO) und cyclisches Guanosinmonophosphat (cGMP) sind Signalmoleküle, welche an zahlreichen physiologischen Prozessen beteiligt sind. NO stimuliert die lösliche Guanylylcyclase (NO-GC), die cGMP aus Guanosintriphosphat (GTP) synthetisiert. cGMP steuert physiologische Prozesse durch die Aktivierung von cGMP-Effektorproteinen wie cGMP-abhängige Proteinkinasen (cGKs), cyclische Nukleotid gesteuerte Kationenkanäle (cyclic nucleotide gated channels; CNG Kanäle) oder Phosphodiesterasen (PDE). Des Weiteren bauen PDEs cGMP zu GMP ab. Der cGMP Signalweg beeinflusst u.a. den Gefäßtonus, Knochenwachstum, Neurotransmission sowie Lernen und Gedächtnis. Im Gegensatz zum kardiovaskulären System, bei welchem die funktionellen Implikationen der NO-cGMP-Signalkaskade bereits relativ gut erforsch sind, ist die Rolle dieses Signalsystems im Nervensystem weitgehend unbekannt. In dieser Arbeit haben wir Echtzeit-Fluoreszenzmikroskopie und andere biochemische Methoden verwendet, um den NO-cGMP-Signalweg im Nervensystem zu untersuchen. Des Weiteren haben wir eine Methode entwickelt, die eine zelltypspezifische Generierung von NO ermöglicht. Im ersten Teil der Arbeit wurde die Wechselwirkung zwischen cGMP und Ca2+, einem weiteren Signalmolekül, welches an neuronalen Funktionen beteiligt ist, weiter aufgeklärt. Für die simultane Messung beider Signalmoleküle in isolierten Kleinhirn Körnerzellen (cerebellar granule neurons; CGNs) haben wir ein mikroskopisches Echtzeit-Imaging Verfahren angewendet. Für die Visualisierung von cGMP wurde der Förster Resonanz Energietransfer (FRET)-basierte Sensor cGi500 verwendet. Für die Aufzeichnung von Ca2+ Signalen wurde der Ca2+-sensitive Farbstoff Fura-2 eingesetzt. cGMP Signale wurden in kultivierten CGNs oder akut isolierten Kleinhirnschnitten aus transgenen Mäusen gemessen, welche den cGi500 Sensor exprimierten. Die Präparate wurden mit dem NO-Donor DEA/NO stimuliert. DEA/NO erhöhte die intrazelluläre cGMP-Konzentration und verstärkte Glutamat-induzierte Ca2+ Signale in CGNs. Diese DEA/NO-induzierten Effekte fehlten in CGNs, welche aus NO-GC Knockout-Mäusen isoliert wurden. Darüber hinaus konnten die Glutamat-induzierten Ca2+-Signale in CGNs auch durch Applikation zweier unterschiedlicher cGMP-Analoga (8-Br-cGMP bzw. 8-pCPT-cGMP) verstärkt werden. Diese Analoga aktivieren cGMP-Effektor Proteine wie cGKs oder CNG Kanäle. Mittels Western Blot Analysen mit viii spezifischen Antikörpern konnten wir weder für cGK Typ I noch cGK Typ II eine Expression in unseren primären CGN-Kulturen nachweisen. Durch Zugabe von PDE-Inhibitoren während der Messung von cGMP konnte gezeigt werden, dass CGNs cGMP über Zaprinast-sensitive PDEs abbauen, höchstwahrscheinlich durch PDE5 und/oder PDE10, aber nicht über PDE1, 2 oder 3. Zusammenfassend beschreiben diese Daten eine cGK-unabhängige NO-cGMP-Signalkaskade, welche die Glutamat-induzierten Ca2+-Signale in CGNs verstärkt. Diese Wechselwirkung zwischen cGMP und Ca2+ beeinflusst vermutlich Neurotransmitter-stimulierte Funktionen in CGNs. Im zweiten Teil der Arbeit wurde eine neue Methode entwickelt, die eine zelltypspezifische Generierung von NO ermöglicht. In vitro ist es bereits möglich den NO-cGMP Signalweg in ausgewählten Zelltypen zu untersuchen, jedoch bestand diese Möglichkeit bisher nicht für in vivo-Studien. Hier beschreiben wir eine neue Methode, welche auf der Verwendung von transgenen Mäusen und der Substanz -Gal-NONOat basiert. Diese Substanz setzt NO nur in Gegenwart des Enzyms β-Galaktosidase frei. Durch eine Cre/loxP gesteuerte Expression des lacZ-Gens, welches für die -Galaktosidase kodiert, war es möglich, NO in spezifischen Zelltypen freizusetzen. Durch die Zugabe von -Gal-NONOat wurde nur in β-Galaktosidase exprimierenden glatten Muskelzellkulturen die intrazelluläre Konzentration von cGMP erhöht. Dies haben wir auch bei β-Galaktosidase exprimierenden Purkinje Zellen in Kleinhirnschnitten beobachtet. Weiterhin haben wir in einem transgenen Mausmodell, in dem β-Galaktosidase lediglich in Neuronen exprimiert wird, -Gal-NONOat verwendet, um Vasodilatation in vivo über neuronal generiertes NO herbeizuführen. Zusammengefasst haben wir in dieser Arbeit den prinzipiellen Nachweis der zelltypspezifischen Generierung von NO durch Verabreichung von -Gal-NONOat in Zellkultur, Gewebeschnitten und in vivo demonstriert. In Zukunft kann diese Methode dazu verwendet werden, um den Einfluss der Bildung von NO durch spezifische Zelltypen auf diverse biologische Prozesse zu untersuchen.