Komparative Analyse der CDR3-Region einer alpha beta Progenitorpopulation und den daraus entstandenen alpha beta T-Zellen insbesondere resultierend durch die Stimulation mit Tumor- und Virus-spezifischen Peptiden

Abstract

Tumor-spezifische T-Zellen, die definierte Epitope auf dem Tumor von Patienten erkennen, finden bereits seit mehreren Jahren therapeuthische Anwendung. Durch ihre Spezifität ist ihre Gabe mit einem hohem anti-tumoralem Effekt und geringen Nebenwirkungen verbunden. Durch die Generierung von T-Zellen, die Gewebe-spezifisch exprimierte Epitope erkennen, kann die zytolytische Wirkung ebenfalls gezielt auf ein Gewebe beschränkt werden. Nach Chemotherapie und Transplantation kann durch sie das Risiko eines Rezidivs gesenkt oder gar ganz vermieden werden. Da die T-Zellen spezifisch sind, können sie beispielsweise auch von einem haploidenten oder MUD (matched unrelated donor) Spender generiert werden. Nicht nur bei Tumorerkrankungen, auch bei Virusinfektionen wie z.B. ADV, CMV, EBV oder HIV spielen spezifische T-Zellen eine wichtige Rolle in der Immunkompetenz und damit für immunsupprimierte Patienten. Auf molekularer Ebene lassen sich T-Zellen anhand ihrer verwendeten TCR-Segmente und ihrer einzigartigen CDR3-Region diskriminieren, ebenso wie durch die selektive Bindung an Epitop beladene Tetramere. In wenigen Fällen werden Gemeinsamkeiten, bzw. idente TCRs bei nicht-verwandten Individuen beobachtet, die man als public TCRs bezeichnet. In der vorliegenden Arbeit wurden für die Validierung von in silico identifizierten Hämatopoese-restringierten potentiell immunogenen Epitopen initial naive, Antigen-unerfahrene CD45RO- CD8+ T-Zellen eingesetzt. Da keines der untersuchten Epitope bei verschiedensten jeweils Epitop-HLA-gematchten Spendern mit entsprechender SNP Konstellation eine T-Zellantwort induziert werden konnte, wurden Bulk Vδ1+ T-Zellkulturen oder Vδ1+ CD4+ T-Zellklone zur Generierung von Virus-spezifischen αβ T-Zellen verwendet. Ihre Differenzierung in der Kultur mit verschiedenen Virus- und Tumor-Peptid gepulsten autologen Feederzellen wurde gemonitort und die Transdifferenzierung zu αβ T-Zellen auf molekularer und zellbiologischer Ebene dokumentiert sowie ihre Spezifität untersucht. Da Vδ1+ CD4+ T-Zellklone das Potential eines αβ T-Zellprogenitors besitzen, wurden sowohl die CDR3-Region der eingesetzen Klone als auch die der transdifferenzierten αβ T-Zellen per Direktsequenzierung identifiziert. Keiner der Versuchsansätze konnte Tetramer-bindende Epitop-spezifische T-Zellen generieren. Die Diversität der jeweiligen CDR3-Sequenzen, die die generierten T-Zellen zeigten, war jedoch unerwartet hoch. Interessanterweise waren sie zwar für das eingesetze Peptid nicht spezifisch, jedoch wiesen sie überraschend häufig Gemeinsamkeiten mit CDR3-Regionen Tumor- oder Viruspeptid-spezifischer publizierter TCRs auf. Damit kann ein erheblicher Anteil an generierten und identifizierten TCRs der transdifferenzierten αβ T-Zellen als public deklariert werden. Um diesen Versuchsansatz für die Anwendung in der Klinik zur Generierung epitopspezifischer T-Zellen einsetzbar machen zu können muss jedoch die Progenitorfrequenz deutlich erhöht werden, damit die statistische Wahrscheinlichkeit gegeben ist, dass verläßlich ein αβ TCR generiert wird, der das eingesetzte Peptid erkennen kann. Begleitend dazu wurden funktionelle Studien zur Identifikation des Triggers der Transdifferenzierung durchgeführt. Dabei konnten Vδ1+ CD4+ T-Zellklone alleine oder im Kontext mit DN und CD8+ Vδ1+ T-Zellen erneut erfolgreich unter Standardkulturbedinungen zu αβ T-Zellen transdifferenziert werden. Ein formeller Beweis bzw. der ausschlaggebende Parameter, der diese Differenzierung induziert, konnte aber in dieser Arbeit erneut nicht identfiziert werden. Untersuchungen der Ligandenbindenden Region der Vδ1 TCRs der CD4+ Klone zeigten in den nicht Keimbahn-kodierten CDR3-Regionen der δ-Ketten teilweise identische Sequenzen in unterschiedlichen Probanden.