Inhaltszusammenfassung:
Staphylococcus aureus (S. aureus) ist ein grampositives Bakterium mit „gespaltener Persönlichkeit“. Staphylokokken kommen als Teil der natürlichen Hautflora vor, können aber auch als pathogenes Bakterium Haut- und Wundinfektionen bis hin zu tödlich verlaufenden Blutstrominfektionen verursachen. Der Übergang von apathogener Kolonisation zu invasiver Infektion wird durch eine Vielzahl von Genregulatoren moduliert.
Ein wichtiger Genregulator bildet das Accessory Gene Regulator (Agr) System, das für die Modulation von über hundert Genen verantwortlich ist. Der agr locus besteht aus zwei Transkriptionseinheiten, die von zwei divergenten Promotoren, agr P2 und agr P3 kontrolliert werden. Das Agr System ist ein klassisches Zwei-Komponentensystem und wird über einen Quorum Sensing Mechanismus gesteuert, wobei das autoinduzierende Protein autoinducing peptide (AIP) von Staphylokokken in den Extrazellulärraum sezerniert wird. Durch Rückbindung an seinen Rezeptor, der Histidinkinase AgrA, kommt es zur Selbstaktivierung des Agr Operons über den agr P2 Promotor, sowie zur Aktivierung von verschiedenen Zielgenen über den agr P3 Promotor: Die aktivierte Genexpression der regulatorischen RNAIII (ausgehend von dem Promoter agr P3) führt u.a. zur Expression des capA-P Biosynthesegencluster welches für Enzyme zur Synthese Kapselpolysaccharide (CP) führt. Das capA-P Operon wird durch einen Promoter upstream von capA (cap-P) gesteuert. CPs schützen Staphylokokken vor der Opsonophagozytose durch Immunzellen, führen aber gleichzeitig zur Maskierung von Oberflächenmolekülen und mindern somit die Fähigkeit zur Adhärenz an Gewebeoberflächen. Analysen mittels fluoreszenzaktivierter Durchflusszytometrie, sowie Immunfluoreszenzmethoden haben gezeigt, dass nicht alle Staphylokokken in der postexponentiellen Phase innerhalb einer Kultur CP produzieren, sondern sich phänotypisch heterogen präsentieren.
Das Ziel der Studie war, Reporterstämme herzustellen, mit denen die Aktivitäten der Promotoren agr-P3 und cap-P auf der Ebene einzelner Zellen simultan analysiert werden können. Hierzu wurden Promotern mit Fluoreszenzproteingenen in Integrationsvektoren kloniert und chromosomal in das Staphylokokkenchromosom integriert. Dabei wurden Plasmide verwendet die entweder in die „attachment site“ für die Pathogenitätsinsel I (SaPI) oder die mittels eines Phagen (attachment site in geh) integrieren. Es konnten Plasmide mit verschiedenen Kombinationen von den Fluoreszenzgenen Venus (ven) oder Verulean (cer) und verschiedenen Selektionsmarkern getestet werden. Dadurch sollte es möglich sein, Doppel-Integranten mit agr-P3-cer, agr-P3 ven, capA-cer, capA-ven herzustellen. Die generierten Stämme wurden mittels PCR auf korrekte Integration überprüft und die Fluoreszenz mikroskopisch detektiert. dienen. Es konnte gezeigt werden, dass alle Reporterstämme das Vektorplasmid an den zu erwartenden Stellen chromosomal integriert hatten. In einem Fall kam es zur partiellen Deletion des Integrationsplasmids und in mindestens einem Fall konnte gezeigt werden, dass es zur Mehrfachintegration des Vektors kam. Die Fluoreszenzuntersuchungen zeigten, dass 1. die agr-P3 Aktivität größtenteils homogen ist und maximal in der post-exponentiellen Wachstumsphase ist. 2. die cap-P Aktivität ist ebenfalls maximal in der post-exponentiellen Wachstumsphase. 3. cap-P Aktivität ist sehr heterogen innerhalb einer Kultur. 4. Promoterfusionen mit ven zeigten ein stärkeres Signal als Fusionen mit cer. 5. Die Analyse der Doppel-Integrante lieferte inkonsistente Ergebnisse und bedarf der weiteren Überprüfung.
Im zweiten Teil dieser Arbeit sollte einer 3D-Kollagenmodells, in dem die Reporterstämme über einen längeren Zeitraum beobachtet werden können, etabliert werden. Guggenberger et al. konnten zeigen, dass Staphylokokken, die in Kollagen mit Fibrinogen eingebettet werden, eine Pseudokapsel aus Fibrinablagerungen und eine Mikrokolonie-assoziiertes Netzwerk ausbildeten (Guggenberger C, Wolz C, Morrissey JA, Heesemann J (2012) Two Distinct Coagulase-Dependent Barriers Protect Staphylococcus aureus from Neutrophils in a Three Dimensional in vitro Infection Model. PLoS Pathogens). Diese Strukturen sind einem Abszess sehr ähnlich und der Versuch kann daher ein in vitro Abszess-Modell darstellen. Es gelang abszessähnliche Strukturen von S. aureus innerhalb einer Kollagen-Matrix zu generieren. Allerdings konnte die Ausbildung der Pseudokapsel oder des Mikrokolonie-assoziierten Netzwerks nur partiell beobachtet werden. Die Analyse der Promotor-Aktivität innerhalb der Kollagen/Fibrin-Struktur zeige folgende, vorläufige Ergebnisse: 1. die Fluoreszenzintensität war für beide Promotor-Fusionen deutlich geringer als bei Wachstum der Stämme in flüssigem Kulturmedium. 2. Die cap-P Promoteraktivität scheint deutlich höher als die agr-P Aktivität zu sein. 3. Bakterien an der Peripherie der Struktur zeigten höhere Fluoreszenz. Die Ergebnisse legen einen Grundstein zur weiteren Etablierung eines Systems zur Analyse von Promoter-Aktivitäten innerhalb eines in vitro Abszess-Models.
Abstract:
Staphylococcus aureus (S. aureus) is a gram-positive bacterium with a “split personality”. Staphylococci are part of the normal skin flora, but can also cause skin and wound infections as well as fatal septicaemia. The mechanism of transition from apathogenic colonisation to invasive infections is modulated by several gene regulators.
An important gene regulator is the Accessory Gene Regulator (Agr) system, which is responsible for the modulation of hundreds of genes. The agr locus consists of two transcriptional units expressed from two divergent promoters P2 and P3. The Agr system is a typical two-component system and is regulated by a quorum sensing mechanism, whereby staphylococci produce an extracellular autoinducing peptide (AIP). AIP binds to its receptor, the histidine kinase AgrA and causes the autoinduction of the Agr operon itself through the agr P2 promoter, as well as the activation of various target genes through the agr P3 promoter. Gene expression is activated by a regulatory RNAIII molecule (originating from the agr P3 promoter) and, among other regulatory functions, leads to the expression of the capA-P biosynthesis cluster, which leads to the synthesis of capsular polysaccharide (CP). The capA-P operon is controlled by the capP promoter upstream of capA. CPs protect staphylococci from opsono-phagocytosis, but also mask surface molecules and therefore reduce the ability of staphylococci to adhere to tissue surfaces. Analysis using fluorescence-activated cell sorting and immunofluorescence staining have revealed that not all staphylococci within a single culture produce CP in the post-exponential phase, but rather present phenotypically heterogeneous.
The aim of this study was to establish reporter strains to simultaneously analyse the activity of both the agr-P3 and the cap-P promoter on a single cell level. For this, promoters with fluorescence proteins were cloned into integration vectors and integrated into the S. aureus chromosome. We used integration vectors that either used the S. aureus pathogenicity island I (SaPI-I) as an attachment site, or integrated with a phage (attachment site geh). Plasmids with various combinations of fluorescence genes Venus (ven) or Cerulean (cer) and different selection markers were tested. The generated strains were verified using PCR to confirm correct integration, and phenotypically analysed using confocal fluorescence microscopy. We were able to show that all reporter strains had successfully integrated the vector plasmid at the correct attachment site. In one case, partial deletion of the integration plasmid was observed. In another case, we were able to detect multiple integration of the vector. Fluorescence microscopy revealed that 1. Agr-activity is largely homogeneous and is highest in the post-exponential phase. 2. cap-A activity is also at highest levels in the post-exponential phase. 3. cap-P activity is highly heterogeneous within a single culture. 4. Promoter fusion constructs with Venus displayed a stronger fluorescence signal than fusion constructs with Cerulean. 5. The analysis of the double reporter strain gave inconclusive results and needs to be analysed further.
In the second part of this work, we aimed to establish a 3D collagen model, in which reporter strains could be observed over an extended period. Guggenberger et al. have shown that embedding staphylococci in collagen with fibrinogen led to the formation of a pseudocapsule from fibrinogen deposits, as well as a surrounding microcolony-associated meshwork (Guggenberger C, Wolz C, Morrissey JA, Heesemann J (2012) Two Distinct Coagulase-Dependent Barriers Protect Staphylococcus aureus from Neutrophils in a Three Dimensional in vitro Infection Model. PLoS Pathogens). These structures are similar to those found in an abscess, therefore we aimed to simulate an in vitro abscess with our model. Pseudocapsule and a microcolony-associated meshwork formation was observed partially. Analysis of promoter activity within the collagen/fibrinogen-structure revealed preliminary results: 1. The intensity of fluorescence signal was weaker for both promoter fusion genes compared to growth in liquid medium. 2. cap-Promoter activity seems significantly higher than agr activity. 3. Bacteria in the periphery of a microcolony displayed higher levels of fluorescence. These results represent first steps towards the establishment of a system to analyse promoter activity within an in vitro abscess model.
confocal microscopy
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