The immunopeptidomic landscape of clear cell renal cell carcinoma: identification and characterization of T-cell epitopes for immunotherapeutic approaches

Abstract

Current therapy of ccRCC is commonly constrained by low response rates and frequent resistance against administered drugs. In recent years, drug discovery is focusing on the positive modulation of the immune system. The lately approved checkpoint ab nivolumab for treatment of ccRCC is the first drug in the upcoming era of immunotherapy. Being an immunogenic tumor entity, specific immunotherapies have the potential to increase the anti-cancer response with lower side effects.

To identify suitable targets for a specific immunotherapy a comprehensive analysis on the HLA ligandome of 58 ccRCC samples and corresponding adjacent benign tissues was conducted by LC-MS/MS and compared to an additional in-house database of benign immunopeptidomes. TUMAPs were selected according to several evaluations focusing on tumor exclusivity, quantitative expression and HLA restriction as well as the biological role of the source antigens. Overall, 26 peptides from six HLA alleles were selected and screened for their immunogenicity in CD8+ T cell priming experiments, with 19 peptides exhibiting immune recognition. This set of peptides can be considered for future specific immunotherapeutic approaches.

HLA-C as well as HLA-E and HLA-G molecules possess important roles in both the innate and adaptive immunity with different immunomodulatory functions. However, the uncovering of the peptide motifs received insufficient attention until recent data from in vitro binding experiments for HLA-C allotypes.

For this purpose, the characterization of the binding specificities of the most frequent HLA-C allotypes as well as HLA-E and HLA-G were accomplished by LC-MS/MS-based identification of naturally processed and presented HLA ligands from monoallelic C1R transfectants. HLA-C allotypes display anchors in the B or C pocket (position 2 or 3 within the peptide) and a less variable anchor in pocket F (C-terminal position within the peptide). Overall, 20,156 HLA-C ligands were identified. For HLA-E the previously reported small ligand repertoire could be confirmed with five identified ligands, whereas a large ligand repertoire for HLA-G (2258 ligands) could be unveiled with anchor positions 3 and 9 and an auxiliary anchor at position 1. The data was utilized to establish SYFPEITHI matrices for epitope prediction and for peptide assignment to the correct HLA. Especially for HLA-G the number of HLA ligands could be tremendously increased from three prior known HLA ligands within the IEDB database to more than 2000 HLA ligands.

Die gegenwärtige Therapie vom klarzelligem Nierenzellkarzinom ist, sowohl durch eine niedrige Ansprechrate als auch durch die häufig auftretenden Resistenzen gegenüber der angewandten Medikation begrenzt. Dies ist ein Grund weshalb der Fokus immer weiter in Richtung Modulation des Immunsystems gesetzt wird. Der kürzlich für ccRCC zugelassene Checkpoint-Inhibitor-Antikörper Nivolumab ist das erste Medikament der bevorstehenden Ära der Immuntherapie. Spezifische Immuntherapien haben aufgrund der Immunogenität von ccRCC das Potential höherer Anspruchsraten als auch geringerer Nebenwirkungen.

Um geeignete Angriffsziele für eine spezifische Immuntherapie zu identifizieren wurde eine umfangreiche Analyse des HLA Ligandoms von 58 ccRCC Proben und entsprechendem benachbarten Normalgewebe mittels LC-MS/MS durchgeführt und zusätzlich mit einer internen Immunpeptidom-Datenbank von diversen gesunden Organen verglichen. TUMAPs wurden durch Anwendung unterschiedlicher Auswertungen ausgewählt, die sowohl deren Tumorexklusivität, quantitative Expression und HLA-Restriktion als auch die Funktion des Quellantigens berücksichtigten. Insgesamt wurden 26 Peptide von sechs HLA-Allotypen ausgewählt und auf deren Immunogenität in CD8+ T Zell-Priming-Experimenten überprüft. 19 von 26 Peptiden konnten im Komplex mit HLA durch CD8+ T Zellen gesunder Spender erkannt werden. Dieses Set an Peptiden kann für zukünftige spezifische immuntherapeutische Ansätze in Betracht gezogen werden.

HLA-C- als auch HLA-E- und HLA-G-Moleküle nehmen sowohl in der angeborenen als auch in der adaptiven Immunität diverse immunmodulatorische Funktionen ein. Nichtsdestotrotz wurden viele HLA-C-Bindemotive erst kürzlich über in vitro Bindungsexperimenten angegangen.

Aus diesem Grund wurden die Bindungsspezifitäten der häufigsten HLA-C-Allotypen als auch die Bindungsspezifitäten von HLA-E und HLA-G charakterisiert. Hierfür wurden natürlich prozessierte und präsentierte HLA-Liganden aus monoallelischen C1R-Transfektanten mittels LC-MS/MS identifiziert. HLA-C-Allotypen zeigen Ankerpositionen in der B- oder C-Tasche (Interaktion mit Position 2 bzw. 3 im Peptid) und einen wenig variablen Anker in der F-Tasche (Interaktion mit C-terminaler Position im Peptid). Insgesamt wurden 20.156 HLA-C-Liganden identifiziert. Für HLA-E wurde das bekannte kleine Ligandenrepertoire (5 identifizierte Liganden) bestätigt, wohingegen das breite Repertoire von HLA-G (2258 Liganden) aufgedeckt werden konnte. Position 3 und der C-Terminus des Liganden bilden hierbei die Ankerpositionen und Position 1 einen Hilfsanker. Die Daten wurden verwendet um SYFPEITHI-Matrizen für die Epitopvorhersage als auch für die Peptidzuordnung zum entsprechenden HLA Molekül zu etablieren. Insbesondere für HLA-G konnte die Anzahl der HLA Liganden massiv von bisher drei bekannten Liganden IEDB Datenbank) auf über 2000 Liganden gesteigert werden.