Immunzytochemische Charakterisierung von CRB1 in humanen iPS-Zell-generierten retinalen Organoiden

Abstract

Einige progressive degenerative Erkrankungen der Retina, welche mit einer Photorezeptorendegeneration einhergehen, wie Retinitis pigmentosa und Lebersche Kongenitale Amaurose, treten durch eine schwere visuelle Beeinträchtigung oder sogar Blindheit von Geburt oder Kindheit an in Erscheinung. Sie werden in bis zu 4 % aller RP-Fälle und in bis zu 15 % aller LCA-Fälle durch eine Mutation innerhalb des CRB1-Gens hervorgerufen. Protokolle, welche retinale Organoide aus hiPS-Zellen generieren, scheinen für die Untersuchung der Retinaentwicklung und auch für die Untersuchung solcher degenerativer Erkrankungen geeignet zu sein. In unseren Untersuchungen verwenden wir ein Protokoll, basierend auf dem von Zhong et al. 2014, das uns erlaubt aus hiPS-Zellen Embryoid Bodies zu generieren und über eine neuronale Differenzierung retinale Organoide herzustellen. Durch einen Wechsel einer Suspensionskultivierung und einer adhärenten Kultivierung werden Augenbläschen hergestellt, welche zu verschiedenen Zeitpunkten durch Kryokonservierung, Kryoschnitte und eine anschließende Immunfärbung unter einem Fluoreszenzmikroskop untersucht werden können. Bei der Betrachtung können alle wesentlichen Zelltypen der Neuralen Retina, die Ganglienzellen, die Amakrin- und Horizontalzellen, die Bipolarzellen, die Müllerzellen und die Photorezeptoren, in einer primitiven Schichtung beobachtet werden. Das retinale Pigmentepithel befindet sich zentral in den retinalen Organoiden und nicht an physiologischer Stelle, angrenzend an die Photorezeptoren. Durch die langzeitige Kultivierung der retinalen Organoide können reife Photorezeptoren mit segmentähnlichen Gebilden gezeigt werden. Innerhalb dieser Segmente lassen sich sogar funktionelle Schlüsselproteine wie beispielsweise Pde6b nachweisen. Das Crb1-Protein kann innerhalb des retinalen Organoids oberhalb der äußeren Grenzmembran lokalisiert werden und zeigt sich im engen Zusammenspiel mit entstehenden Photorezeptorsegmenten. Es wird hier gezeigt, dass dieses Modell aus hiPS-Zellen retinale Organoide zu bilden eine gute Möglichkeit bietet, die Fortschritte der degenerativen Retinaerkrankungen weiter voran zu treiben und genauere Analysen der Photorezeptorenentwicklung und des CRB1-Gens innerhalb der Retinaentwicklung durchzuführen. Um ein tiefgreifenderes Verständnis dieser Krankheiten mit Photorezeptorendegeneration zu erlangen, werden weitere Untersuchungen in Zukunft unverzichtbar sein.