Effect of Anoctamin 6 and γ-secretase inhibitor DAPT on platelet activation and apoptosis

Abstract

Es ist wohlbekannt, dass Ca2+ vielfältig zu zahlreichen Schritten der Thrombozytenaktivierung und -apoptose beiträgt. Das erhöhte Plasma-Ca2+ ist hauptsächlich durch Speicherfreisetzung und Orai1/STIM1-vermittelten speicherabhängigen Ca2+-Einstrom (SOCE) bedingt. Diese Studie untersucht die effekte von Anoctamin 6 (Ano 6) und dem γ-Sekretase-Inhibitor DAPT auf den Ca2+-Signalweg, Aktivierung und Apoptose von Thrombozyten. Ano 6 wurde in vielen Zellarten als Ca2+-gesteuerter Cl--Kanal beschrieben. Defektes Ano 6 liegt dem Scott Syndrom, einer seltenen Blutgerinnungsstörung, die aus einer gestörten Umlagerung der Phospholipide an der Thrombozyten-Zellmembran hervorgeht, zugrunde. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass die Anzahl der Thrombozyten auffallend höher im Blut von ano6-/--Mäusen als von ano6+/+-Mäusen war. SOCE und Orai1-Menge der Thrombozyten waren in beiden Genotypen nicht signifikant verschieden. Außerdem waren die Phosphatidylserin (PS)-Exposition, ROS-Menge, Plättchendegranulation, Integrin αIIbβ3-Aktivierung und intrazelluläre Ca2+-Konzentration ([Ca2+]i) in ruhenden Thrombozyten von ano6+/+- and ano6-/--Mäusen ähnlich. Die Stimulation durch CRP oder Thrombin erhöhte signifikant die [Ca2+]i, P-Selektin-Menge, Integrin αIIbβ3-Aktivierung und Bildung von ROS und triggerte die PS-Exposition sowie Zellschrumpfung in beiden Genotypen. Jedoch verminderten sich alle Effekte deutlich in ano6-/-- gegenüber ano6+/+-Thrombozyten. Schlussfolgernd vermindert defektes Ano 6 die durch CRP oder Thrombin induzierte Aktivierung und Apoptose von Thrombozyten. DAPT inhibiert den γ-Sekretase-Komplex, welches CD44, einen negativen Regulator der Thrombozytenaktivierung und -apoptose, spaltet. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass SOCE in Thrombozyten in Anwesenheit von DAPT signifikant gesenkt wurde. Zusätzlich führte die Exposition der Thrombozyten gegenüber CRP zu einem beachtlichen Zuwachs an [Ca2+]i, Integrin αIIbβ3-Aktivierung, Thrombozyten-Degranulation, mitochondrialer Depolarisation, Orai1 Menge, ROS-Bildung, Annexin-V-Bindung, Zellschrumpfung und -aggregation. Alle Effekte von CRP wurden jedoch von DAPT inhibiert. Schlussfolgernd wirkt der γ-Sekretase-Inhibitor DAPT einer CRP-induzierten Thrombozytenaktivierung, -apoptose und -aggregation entgegen.