Tissue Engineering einer Leber

Abstract

Durch den Mangel an Spenderorganen kann in der Transplantationsmedizin der Bedarf an Organersatz nur teilweise gedeckt werden. Daher sind durch Tissue-Engineering auf Basis tierischer Matrices erzeugte Ersatzorgane eine attraktive Alternative. Zur Generierung dieser zellfreien Matrices stehen verschiedene Methoden zur Verfügung, die jedoch meistens zeitintensiv sind und keinem standardisierten Prozess unterliegen. Das Ziel dieser Doktorarbeit war die Etablierung eines kürzeren und schonenderen Azellularisierungsprozesses sowie in weiteren Schritten die Wiederbesiedelung solcher Matrices mit porcinen Hepatozyten. Für die Entwicklung eines neuen Azellularisierungsprotokolles wurden Lebern aus Göttinger Minipigs mit Hilfe eines computergestützten, zirkulierenden Systems mit einer 1% Sodiumdodecylsulfatlösung bei 37°C bei einem vorgegebenen Druck von 20 mmHg für durchschnittlich 24 h gespült. Neben dem Detergenz SDS wurde noch das Enzym DNase für eine komplette Beseitigung der tierischen DNA eingesetzt. Zur Überprüfung der Matrices wurden DNA-, Kollagen- und Glykosaminoglykangehalt bestimmt, sowie H&E-Färbungen angefertigt. In einem zweiten Schritt erfolgte die Etablierung von Stoffwechseltests, wie die Messung der Galaktoseelimination, die Albuminmessung oder die Beurteilung der Zellviabilität. Die verwendeten Medien waren Hepatozytenmonolayer und Hepatozyten-3-D-Strukturen, wofür porcine Hepatozyten in ca 1 cm3 großen Matrixstückchen angesiedelt wurden. Im letzten Schritt erfolgte die Wiederbesiedelung einer azellularisierten, porcinen Lebermatrix mit primären, porcinen Hepatozyten über die Zeitabschnitte von 48, 72 und 96 h. Die Wiederbesiedelung erfolgte mit Hilfe eines computergestützten, zirkulierenden Systems. Für die Evaluierung der wiederbesiedelten Matrices erfolgten eine Albuminmessung, die Bestimmung der Galaktoseelimination, sowie die Färbung von Schnitten mit H&E und Ki-67. Die vorgestellte Arbeit zeigt, dass eine porcine Leber in 24 h in einem standardisierten Prozess mit 1% SDS erfolgreich azellularisiert werden kann, um ein Organgerüst zu erhalten, welches für die Herstellung von Gewebsstrukturen geeignet ist. Die Wiederbesiedelungsversuche mit porcinen Hepatozyten ergaben, dass die Zellen das vaskuläre Netzwerk nutzen, um das Portalfeld zu erreichen und einen Zellverbund zu bilden. Die mit Ki-67 positiv gefärbten Zellen lassen auf einen aktiven Teilungszustand der Zellen während der Zeitläufe 48 und 72 h schließen, während nach 96 h ein Zelluntergang zu erkennen ist. In Grundzügen konnte gezeigt werden, dass die Wiederbesiedelung einer Matrix mit Zellen möglich ist.