The role of stimulating bystander cells in bispecific antibody-mediated T cell activation

Abstract

Recently, bispecific monoclonal antibodies (BsMAb) yielded promising results regarding the treatment of various malignant diseases. However, the serum levels that can be safely achieved in humans remain suboptimal in terms of saturation of the tumor-associated antigen (TAA), as the application of higher doses results in systemic cytokine release and transient leukopenia. Off-target activation of circulating immune cells, stimulated by the BsMAb, could explain most of the side effects observed after in-vivo application of BsMAb. In this work, immunoassays were conducted, which showed that BsMAb are capable of inducing T cell proliferation in the absence of target cells. Furthermore, it was demonstrated that human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) as well as various lymphoid cell lines markedly amplify this effect. They are acting as stimulating bystander cells (SBCs). Several lymphoid and non-lymphoid cell lines did not exhibit this property, thus ruling out allogeneic effects. Functional assays were conducted to characterize blocking antibodies directed against costimulatory and adhesion molecules on both stimulating bystander cells and immune cells, that are capable of reducing off-target activation. Antibodies against CD54, CD2, and TNFα reduced off-target activation markedly, whereas antibodies directed against CD18 as well as prednisolone blocked it completely. Further experiments addressed the effect of blocking reagents on the induction of on- target activation and subsequent killing of tumor cells by T cells after stimulation with BsMAb. Prednisolone and aCD2 antibodies impaired tumor cell killing markedly, while only minor reduction was observed with aCD18 and aTNFα antibodies. Using an adhesion assay, it was shown that PBMCs adhere to a HUVEC layer to a higher extent when stimulated with BsMAb compared to unstimulated PBMCs. Antibodies directed against CD18 could greatly reduce this phenomenon. In summary, aCD18 and aTNFα antbodies appear to be promising agents for the prevention of cytokine release after application of BsMAb. Eventually, they could replace prednisolone as first line drug, since prednisolone exerted a pronounced inhibition of BsMAb-induced tumor cell killing. However, further in-vivo assays need to be conducted to further characterize the blocking properties of aCD18 and aTNFα blocking antibodies and possible side effects, such as a higher susceptibility to infection.

In den letzten Jahren erzielten bispezifische monoklonale Antikörper (BsMAb) bemerkenswerte Erfolge in der Behandlung von malignen Erkrankungen. Die in Menschen erreichbaren Serumkonzentrationen dieser Antikörper sind jedoch nicht ausreichend, um die anvisierten Tumorantigene (TAA) zu sättigen. Der Grund dafür ist das Auftreten eines Zytokinfreisetzungssyndroms und einer transienten Leukopenie. Die Aktivierung von zirkulierenden Immunzellen durch BsMAb abseits von Tumorzellen würde die meisten Nebeneffekte erklären, die bisher beobachtet wurden. In dieser Arbeit wurden Immunassays durchgeführt, die zeigten, dass BsMAb T-Zell-Proliferation in der Abwesenheit von Zielzellen induzieren können. Außerdem konnte gezeigt werden, dass humane Nabelschnurvenenendothelzellen (HUVECs) sowie verschiedene lymphatische Zelllinien diesen Effekt verstärken. Deswegen wurden sie im weiteren als stimulierende Bystanderzellen (SBCs) bezeichnet. Andere lymphatische und nicht-lymphatische Zellen verstärkten die unspezifische Aktivierung nicht, wodurch ein rein allogener Effekt ausgeschlossen werden konnte. Blockierende Antikörper, die gegen bestimmte Zytokine, kostimulierende und Adhäsionsmoleküle auf Immunzellen und stimulierenden Nebenzellen gerichtet waren, konnten die unspezifische Aktivierung reduzieren. So konnten Antikörper gegen CD54, CD2 oder TNFα den Effekt deutlich eindämmen. Antikörper gegen CD18 sowie das Steroid Prednisolon konnten die unspezifische Aktivierung vollständig unterbinden. Weitere Experimente wurden durchgeführt, um den Einfluss der blockierenden Antikörper auf die BsMAb-induzierte T-Zell-Aktivierung, sowie das nachfolgende Killing von Tumorzellen zu untersuchen. So blockierten Prednisolon und Antikörper gegen CD2 die Aktivierung und Tumorzelllyse vollständig, während Anti-CD18-Antikörper und Anti- TNFα-Antikörper kaum negative Effekte hatten. Mittels eines Adhäsionsassays konnte gezeigt werden, dass PBMCs vermehrt an Endothelzellen (HUVECs) haften, wenn sie vorher mit BsMAb stimuliert wurden. Dieser Effekt konnte mit Antikörpern gegen CD18 unterbrochen werden. Im Endeffekt stellen Antikörper gegen CD18 und TNFα mögliche Medikamente zur Verhinderung von Zytokinfreisetzungssyndromen dar. Nach eingehender Charakterisierung könnten beide Prednisolon als Therapeutikum der Wahl für diese Indikation ersetzen. Letzteres hatte die Anti-Tumor-Aktivität der T-Zellen in den hier durchgeführten Experimenten deutlich eingeschränkt. Nichtsdestotrotz sollten weitere in-vivo Assays durchgeführt werden, um Antikörper gegen CD18 und TNFα weiter zu charakterisieren und mögliche Nebenwirkungen zu erkennen, zum Beispiel eine höhere Anfälligkeit für Infektionen.