Deciphering the BH3 code for the neutralization of pro-survival Bcl-2 proteins in membranes

Abstract

The proteins of Bcl-2 family, the pro-survival and the pro-apoptotic tightly regulates the process of apoptosis. The pro-survival proteins show a specific interaction pattern with BH3 domain of BH3 only proteins, determining the cellular fate during apoptotic stress. This interaction specificity is pivotal in designing BH3 mimetics, a class of anticancer drug molecules based on the BH3 domain of BH3 only proteins showing promising results in clinical trials. The role of the mitochondrial outer membrane in exhibiting Bcl2 complex interactome is extensively studied recently. Overall most studies addressed so far on the interactions of BH3 peptides and the truncated Bcl-2 proteins are reported in the solution / cytosolic environment while the quantitative interactions in membranes are still missing. To tackle this, we systematically quantified the library of BH3 peptides using two-color fluorescence correlation spectroscopy in solution and in the model membrane. We further extended our investigations to isolated yeast mitochondria using ensemble FRET and in mammalian cancer cell lines using a high throughput screening called BH3 profiling. We show that BH3 peptides derived from Hrk and Bim are the most effective in disrupting cBid/Bcl-xL complexes, which correlates with their response in mitochondria and in cells. Moreover, to understand the activation process of pro-apoptotic effector protein Bax on membranes, we designed an ​in-vitro system to investigate its autoactivation by the recruitment of inactive cytosolic Bax molecules by active membrane-bound Bax. Furthermore, ​in vitro studies also showed active membrane-bound Bax recruits Bcl-xL to the membrane, which retrotranslocates active Bax back into the cytosol, thereby maintaining membrane integrity. Quantitative analysis showed that Bax retrotranslocation activity potentiates Bcl-xL antiapoptotic activity by at least 10 fold.

Overall, these findings highlights the importance of the membrane in Bcl-2 family interactions and thereby screening peptides that can disrupt specific interactions of these proteins in the membrane and can improve cancer therapies.

Der mitochondriale Apoptosesignalweg wird durch die anti- und pro-apoptotischen Vertreter der Bcl-2 Proteinfamilie kontrolliert. Die anti-apoptotischen Proteine spielen eine zentrale Rolle, in dem sie durch die selektive Interaktion mit der BH3 Domäne der BH3-only Proteinen den apoptotischen Prozess regulieren. Basierend auf dieser Interaktion und der BH3 Domäne werden BH3-Mimetika, eine Gruppe von anti-Krebs Medikamenten, entworfen. BH3-Mimetika zeigen in klinischen Studien eine signifikante Aktivierung von Apoptose, indem sie diese Interaktion stören. Der Einfluss der äußeren Mitochondrienmembran auf die Interaktion der Bcl-2 Proteinen wird zur Zeit detailliert untersucht. Bisher wurde ausschließlich die Interaktion der BH3 Peptiden mit den verkürzten Formen der Bcl-2 Proteinen nur in Lösung und im Zytoplasma untersucht, während quantitative Interaktionen in Membranen komplett außer Acht gelassen wurden. Um diese Fragestellung anzugehen, haben wir systematisch die Interaktion bestehender BH3 Peptiden mit Hilfe der zwei Farben Fluoreszenz-Korrelations- Spektroskopie, sowohl in Lösung als auch in Modell Membranen, quantifiziert. Wir erweiterten unsere Untersuchungen auf isolierte Hefe Mitochondrien mit Hilfe der FRET Analyse und auf Säugetier Krebszelllinien mit Hilfe des Hochdurchsatz-Screenings BH3 Profiling. Wir zeigen, dass die BH3 Peptide, die von Hrk und Bim abgeleitet wurden, die effektivesten in der Störung des cBid / Bcl-xL Komplexes seien. Diese Daten spiegeln die Antwort in Mitochondrien und in Zellen wieder. Um den Aktivierungsprozess des pro-apoptotischen Effektorproteins Bax an Membranen zu verstehen, haben wir ein in-vitro Assay entwickelt, das erlaubt, die Autoaktivierung von Bax zu untersuchen. Das aktive, membrangebundene Bax rekrutiert dabei das inaktive, zytoplasmatische Bax zu der Membran. Des Weiteren haben in-vitro Analysen gezeigt, dass membrangebundenes Bax, Bcl-xL zu der Membran rekrutiert. Bcl-xL retrotranloziert aktives, nicht oligomerisiertes Bax zurück in das Zytoplasma, um die Membranintegrität aufrecht zu erhalten. Quantitative Analysen zeigen, dass die Bax-retrotranslokationsaktivität die anti-apoptotische Bcl-xL-Aktivität um mindestens das 10fache verstärkt. Unsere Ergebnisse zeigen die Wichtigkeit der Membran für die Interaktion der Bcl-2 Proteinen auf, deshalb ist das Screening von Peptiden, die die Interaktion dieser Proteine an der Membran stört von großer Bedeutung für die Krebstherapie.