Heterogeneous impact of hypoxia on cellular radiation sensitivity of three squamous cell carcinoma lines

Abstract

Hypoxia has been shown to be a negative prognostic marker for survival and the occurrence of metastatic disease for patients with various kinds of tumours. It has been shown previously that for two SCC tumors grown as xenografts in nude mice hypoxic tumour cells showed a significantly lower amount of residual DNA double strand breaks (DSB) compared to normoxic cells. However, it was not possible to assess the duration and exact timing of hypoxia exposure in relation to irradiation in this experimental setting. Therefore, we aimed to study the influence of hypoxia exposure at different timeframes in relation to irradiation on cellular survival and the amount of residual DNA double strand breaks. Three human squamous cell carcinoma cell lines with differences in their intrinsic radiation sensitivity were exposed to hypoxia prior, during or 24 hours after irradiation and consequently either seeded in parallel for colony formation assay (CFA) and for γH2AX assay or processed for western blot analysis. For normoxic conditions we were able to reproduce the observed differences in intrinsic radiosensitivity both in terms of CFA and in terms of γH2AX assay. Irradiation under hypoxic conditions led to an increase in cellular survival and a decrease of residual DSBs with similar oxygen enhancement ratios (OER) for all cell lines (OERmean =2.36). Based on the mean number of residual foci we were able to recalculate the observed survival curves and accurately estimate the OER values. Exposure to hypoxia after irradiation did neither alter cellular survival nor the amount of residual γH2AX foci. Interestingly, long term incubation under hypoxia prior to irradiation resulted in diverse effects on cellular survival, namely radiosensitization in SKX (HMF=0.76), induction of radioresistance in FaDu (HMF=1.54) and no effect in UT SCC-5 cells (HMF=1.10). These phenotypic behaviors were consistent when cells were exposed to hypoxia either during or after irradiation additionally or were chronically hypoxic. Under this condition, western blot analysis revealed increased phosphorylation of ATM and DNA PKcs after irradiation for UT SCC-5 and to a lesser extent also for FaDu cell line. Interestingly, we observed homogenous downregulation of Rad51 after pre-irradiation incubation under hypoxia. In conclusion, our data indicates a significant role for hypoxia tolerance on cellular radiation sensitivity for cells exposed to hypoxia prior to irradiation for prolonged periods of time. Furthermore, our data suggests that ATM might have an important impact on cellular adaptation and cellular survival in a hypoxic microenvironment. Enhancing our knowledge on hypoxia is important to overcome treatment resistance of hypoxic tumors.

Die Tumorhypoxie ist ein weit verbreitetes Phänomen, das zu Metastasierung sowie Therapieresistenz führen kann und so einen negativen Prognosefaktor für das Überleben von Patienten darstellt. Vorarbeiten in vivo zeigten, dass hypoxische Tumorzellen gegenüber normoxischen Tumorzellen signifikant weniger residuelle DNA Doppelstrangbrüche (DSB) nach Bestrahlung aufweisen, wobei die Heterogenität zwischen verschiedenen Tumorlinien abhängig von der Oxygenierung erscheint. Das Ziel dieser Arbeit war die Abhängigkeit der Strahlensensitivität und des Zellüberlebens vom Zeitpunkt der Hypoxieexposition in Bezug auf den Bestrahlungszeitpunkt in verschiedenen Tumorlinien in vitro zu untersuchen. Hierzu wurden drei humane Plattenepithelkarzinomzelllinien des Kopf- und Halsbereiches mit Unterschieden in ihrer intrinsischen Strahlensensitivität ausgewählt. Diese wurden vor, während oder nach der Bestrahlung Hypoxie ausgesetzt und anschließend entweder parallel für die Koloniebildungsassays ausgesät und für den γH2AX Foci Assay gefärbt oder für die Western Blot Analyse vorbereitet.

Die Bestrahlung von Zellen unter hypoxischen Bedingungen führte zu einem Anstieg der Überlebensfraktion sowie zu einer signifikanten Reduktion der Anzahl residualer γH2AX Foci (MW OER: 2,36). Hypoxie nach Bestrahlung führte hingegen zu keiner signifikanten Veränderung des Zellüberlebens. Interessanterweise zeigte die Inkubation unter Hypoxie vor Bestrahlung unterschiedliche Effekte in den drei Zelllinien: Strahlensensibilisierung in SKX (HMF: 0.76), Verstärkung von Strahlenresistenz in FaDu (HMF: 1.54) und keinen Effekt in UT SCC-5 (HMF: 1.10). Diese Phänotypen zeigten sich ebenfalls bei zusätzlicher Hypoxieexposition während oder nach Bestrahlung. Unter dieser Bedingung konnte in der Western Blot Analyse in allen Zellen eine verminderte Expression von Rad51 nachgewiesen werden. Für UT SCC-5 Zellen und zu einem geringeren Anteil auch für FaDu Zellen beobachteten wir eine verstärkte, bestrahlungsbedingte Phosphorylierung von ATM und DNA-PKcs.

Zusammenfassend weisen die Daten dieser Studie darauf hin, dass die intrinsische Hypoxietoleranz einen wichtigen Einfluss auf die zelluläre Strahlensensitivität haben könnte und deuten auf eine wichtige Rolle von ATM für das Zellüberleben und die Anpassung von Zellen an hypoxische Bedingungen hin. Die vorliegenden Ergebnisse sind bedeutend für die Entwicklung von neuen Strategien zur Überwindung der Strahlenresistenz hypoxischer Zellen.