Novel aspects of receptor protein RLP30-mediated detection of Sclerotinia and Pseudomonas patterns

Abstract

Arabidopsis thaliana has evolved a large number of transmembrane cell surface receptors that play major roles during development, organogenesis and responses to external stimuli. One A.thaliana leucine-rich repeat (LRR) receptor-like protein, RLP30, was already associated with a specific function as pattern recognition receptor (PRR) for the novel microbe-associated molecular pattern (MAMP) SCFE1 (Sclerotinia culture filtrate elicitor 1) from the necrotrophic fungus Sclerotinia sclerotiorum, but the identity of SCFE1 remained elusive. Different approaches were used to try to identify the molecular identity of SCFE1 using different chromatography methods, followed by LC-MS/MS analyses or by using a bioinformatics approach. Additionally, an easy Gateway-based cloning and expression system for transient expression in the apoplast of N.benthamiana plants was established, in order to test putative candidate proteins. The two LRR-receptor like kinases (RLK), BRI1-ASSOCIATED KINASE 1 (BAK1) and SUPPRESSOR OF BIR1-1 (SOBIR1), where already shown to be required for RLP-dependent immune responses, using co-immunoprecipitation assays a constitutive ligand-independent interaction of RLP30 and SOBIR1 could be shown, additionally, to the ligand-dependent recruitment of BAK1 to the RLP30-SOBIR1 complex. RLP30 was identified by mapping naturally occurring SCFE1-insensitive Arabidopsis accessions and important amino acid residues for proper function of RLP30 could be identified, targeting most likely putative ligand binding sites or interaction sites for SOBIR1 and/or BAK1. Furthermore, RLP30 was transformed into a functional receptor-like kinase, by fusing the kinase domain of SOBIR1 to the C-terminal end of RLP30, thus transforming the RLP into a genuine RLK. The brassicaceous RLP30 was so far not functional in solanaceous plants, but by co-transforming the Arabidopsis SOBIR1 together with RLP30 in tomato and tobacco plants, an increased resistance in those two plant species against S.sclerotiorum and Botrytis cinerea could be achieved. Furthermore, a novel RLP30-dependent MAMP was purified from different strains of the bacterial genus Pseudomonas, which showed exactly the same biochemical properties like SCFE1, indicating that they share at least the same minimal motif. This is one of very few examples of cross-kingdom occurrence of MAMPs.

Im Genom von Arabidopsis, wie auch in allen anderen höheren Landpflanzen, findet sich eine beträchtliche Anzahl an Genen die für Rezeptoren kodieren die in der Zellmembran lokalisiert sind. Diese Rezeptoren spielen eine wichtige Rolle während der Embryonalentwicklung, der Differenzierung der Organe, sowie in der Perzeption von externen Stimuli. Für ein LRR rezeptorähnliches Protein, RLP30, konnte gezeigt werden, dass es den neu entdeckten MAMP SCFE1 (Sclerotinia culture filtrate elicitor 1) aus dem necrotrophen Pilz Sclerotinia sclerotiorum erkennen kann, jedoch konnte bis jetzt die molekulare Identität von SCFE1 nicht aufgeklärt werden. Durch den Einsatz verschiedener Chromatographie-Techniken und anschließender LC-MS/MS-Analyse, sowie einem bioinformatischen Ansatz sollte versucht werden die molekulare Identität von SCFE1 zu entschlüsseln. Um mögliche Kandidaten testen zu können, wurde ein einfaches Gateway-basiertes Klonierungssystem entwickelt, mit dessen Hilfe Kandidatengene transient im Apoplasten von Nicotiana benthamiana exprimiert werde sollen. Die LRR rezeptor-ähnlichen Kinasen BAK1 und SOBIR1 werden beide in der RLP-abhängigen Signaltransduktion benötigt und in Co-immunoprezipitationsversuchen konnte gezeigt werden, dass SOBIR1 und RLP30 konstitutiv und ligandenunabhängig miteinander interagieren. Außerdem konnte gezeigt werden, dass BAK1 ligandenabhängig zum RLP30-SOBIR1-Komplex rekrutiert wird. RLP30 konnte mit Hilfe von natürlich vorkommenden Arabidopsis Ökotypen identifiziert werden, die insensitive gegenüber SCFE1 sind und mit dessen Hilfe nun auch wichtige Aminosäure identifiziert werden konnten, die für die Funktion von RLP30 unabdingbar sind und höchstwahrscheinlich mögliche Ligandenbindestellen oder Interaktionsstelle mit SOBIR1 und/oder BAK1 betreffen. Zusätzlich könnte das rezeptorähnliche Protein RLP30 durch die C-terminale Fusion der SOBIR1-Kinasedomäne in eine funktionelle rezeptorähnliche Kinase umgewandelt werden. RlP30 aus Brassicaceae war bislang in Pflanzen die zu den Solanaceae gehören nicht funktionell, aber durch das gleichzeitige Transformieren von SOBIR1 aus Arabidopsis und RLP30 in Tomaten- und Tabakpflanzen konnte eine höhere Resistenz in diesen Pflanzen gegenüber S.sclerotiorum und Botrytis cinerea erreicht werden. Abschließende konnte noch ein neuer, ebenfalls RLP30-abhängiger MAMP aus verschiedenen bakteriellen Stämmen, die alle der Gattung Pseudomonas angehören, aufgereinigt werden. Dieser neu-gefundene MAMP zeigte die gleichen biochemischen Eigenschaften wie SCFE1, was darauf hindeuten könnte, dass beide das gleiche immunogene Minimalmotiv teilen. Das ist eines von sehr wenigen Beispielen für ein MAMP, das in sowohl in Prokaryoten als auch in Eukaryoten vorkommt.