Identifizierung und funktionelle Charakterisierung von Phosphorylierungen des HPV31 E8^E2 Proteins

Abstract

Humane Papillomviren (HPV) gehören zu den am häufigsten sexuell übertragbaren Krankheitserregern weltweit. Sie infizieren Keratinozyten der Haut oder Schleimhaut und die sogenannten High Risk HPV Typen sind mit der Entstehung von Oropharynx- und anogenitalen Karzinomen, insbesondere der Zervix, assoziiert. Der virale Lebenszyklus kann in drei Phasen eingeteilt werden. Unmittelbar nach der Infektion kommt es zu einer Genomamplifikation, wodurch die Anzahl der viralen Genome pro Zelle auf 50-100 extrachromosomale Kopien ansteigt. Diese Kopienzahl wird anschließend während der Teilung der Wirtszellen konstant gehalten. Erst nach der Differenzierung erfolgt eine zweite Amplifikationsrunde und neue infektiöse Partikel werden produziert. Die Virusreplikation ist abhängig von den beiden viralen Replikationsproteinen E1 und E2. Darüber hinaus ist E2 an der viralen Transkription sowie der Segregation der viralen Genome während der Zellteilung beteiligt. Für einige HPV Typen konnte gezeigt werden, dass die E2 Proteine in der zentralen Hinge-Region phosphoryliert werden, wodurch die Funktion des Proteins beeinflusst wird. Neben dem vollständigen E2 Protein kodieren humane Papillomviren eine alternative Version von E2, welche als Repressor der viralen Transkription und Replikation fungiert. Das E8^E2 Protein entsteht durch Spleißen, wobei die N-terminale Domäne des E2 Proteins durch eine kurze E8-Domäne ersetzt wird. Da diese Repressorproteine die Hinge-Region mit dem E2 Protein teilen, könnten sie auch durch Phosphorylierungen modifiziert werden. Im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte massenspektrometrische Analysen zeigen, dass sowohl das E2 Protein als auch das E8^E2 Protein des High Risk HPV31 phosphoryliert wird. Phos-Tag Analysen der Proteine bestätigten, dass das Serin 78 die Hauptphosphorylierungsstelle des HPV31 E8^E2 Proteins darstellt, wohingegen das entsprechende Serin bei E2 (S266) nur in einer geringen Fraktion des Proteins phosphoryliert vorliegt. Die Phosphorylierung des HPV31 E8^E2 S78 beeinflusst die Repressionsaktivität des Proteins, wohingegen die Phosphorylierung von E2 keine Auswirkung auf dessen Funktion hat. Durch die Phosphorylierung von E8^E2 an S78 wird weder die Proteinstabilität, Lokalisierung, DNA-Bindeaktivität oder die Interaktion mit dem zellulären NCoR/SMRT-Korepressorkomplex reguliert. Quantitative massenspektrometrische Analysen lassen vermuten, dass die Interaktion von E8^E2 mit anderen zellulären Proteinen durch die S78 Phosphorylierung beeinflusst wird. Überraschenderweise zeigen Mutationen der phosphorylierten Serine im Kontext des gesamten viralen Genoms keine Unterschiede in der viralen Genomkopienzahl oder Transkription in undifferenzierten oder differenzierten Keratinozyten. Allerdings deuten globale Transkriptomanalysen von differenzierten HPV31 E8^E2 S78A und S78E Zelllinien darauf hin, dass durch die Phosphorylierung die Expression einiger weniger zellulärer Gene, wie LYPD2 reguliert wird. Zusammengefasst zeigen die Daten, dass die Hauptfunktion der Phosphorylierung von S78 des HPV31 E8^E2 Proteins darin besteht, die Expression einiger weniger zellulären Gene zu modulieren. Die Replikationsaktivität der viralen E1 und E2 Proteine lässt sich mittels Luziferase-Reporteranalysen in Karzinomzelllinien wie z.B. HeLa untersuchen. Dabei führt die Kotransfektion von Expressionsplasmiden für E1 und E2 und einem Reporterplasmid, welches den viralen Replikationsursprung enthält, zu einer Amplifikation des Reporterplasmids und in Folge dessen zur Zunahme der Luziferase-Aktivität. Überraschenderweise kann in humanen Keratinozyten, welche durch HPV31 E6 und E7 Proteinen immortalisiert wurden (31E6/E7-NHK), keine E1/E2-abhängige Zunahme der Aktivität des Reporterplasmids beobachtet werden. Die Ursache dafür wurde im zweiten Teil dieser Arbeit untersucht. Dabei zeigten die durchgeführten Analysen, dass in 31E6/E7-NHK Zellen das virale E1 Protein nur in geringen Mengen exprimiert wird. Die insuffiziente E1 Expression scheint dabei zur Limitierung der Replikation des HPV-Reporterplasmids beizutragen, jedoch nicht ausschließlich dafür verantwortlich zu sein. Im Einklang mit publizierten Daten führt die Expression von E1 zur Induktion einer DNA-Schadensantwort in 31E6/E7-NHK. Allerdings kann auch nach Inhibition der DNA-Schadensantwort keine Replikation des Reporters beobachtet werden. Vielmehr scheint eine E1/E2-abhängige Replikation in 31E6/E7-NHK von weiteren frühen viralen Proteinen abhängig zu sein.