Functional characterization of the nucleoporins Nup50 and Nup155 in postmitotic nuclear pore complex assembly

Abstract

The nucleus encloses the genetic material of the cell. Contact and exchange between the nuclear and cytoplasmic compartments are tightly regulated by nuclear pore complexes (NPCs), huge multimeric protein complexes that span the double nuclear envelope. These must ensure specific and timely regulated access to the nucleus to all the factors required for its correct development and maintenance. In order to be able to do so, NPCs must form in a tightly regulated fashion, producing transport-competent complexes as a result. The formation of the pores occurs in two different stages of the cell cycle, during interphase and after mitosis. During these stages, the pores are likely assembled by distinct pathways, due to the differences existing in morphology at these moments of the life of the cell. A deeper understanding of the mechanism of interaction of factors involved in NPC formation, which is far to be complete, will contribute to unravel one of the biggest, most complex cellular events. In the course of my PhD, I analyzed interactions and ordered recruitment of nucleoporins. In vitro nuclear assembly using Xenopus egg extracts revealed that a small component of NPCs, nucleoporin Nup50, is required at the early stages of postmitotic NPC assembly. Nup50 is a small nucleoplasmic nucleoporin known to be required for nuclear import. I have identified two distinct sites on the protein that are important for its postmitotic function, each of them dispensable if the other is functional, but required if the other is mutated or compromised. Interestingly, Nup50 binds the NPC assembly initiator MEL28/ELYS; in spite of this, I proved that their interaction is not required for postmitotic NPC assembly, and that they probably perform redundant functions. Additionally, I have studied the role of the domains of nucleoporin Nup155. Nup155 is a membrane binding protein required for postmitotic NPC assembly at a later step than Nup50. It contains an N-terminal domain, which arranges as a beta-propeller fold in its tertiary structure, and a C-terminal domain, which folds as a alfa-solenoid. Depletion of Nup155 causes failure by Xenopus egg extracts to form nuclear pore complexes and a closed nuclear envelope in vitro. Nup155 contains a membrane-binding region within its N-terminal. In vitro nuclear assembly using Xenopus egg extracts show that this membrane binding activity is required at the end of mitosis, as a mutant of Nup155 full length construct affecting the residues involved in membrane binding was not able to replace the endogenous protein in Nup155 depleted extracts to a comparable level with the Nup155 wildtype. Moreover, addback of an N-terminal truncation of Nup155, containing the membrane binding domain, was able to restore nuclear envelope, but not nuclear pore complex assembly. The work further indicates that Nup155 is found in a closed conformation in solution. Its binding site for Nup53 is found in the N-terminal, but it is partially blocked by its C-terminal, that prevents arranging of the optimal surface contact. Nup93 is required for the conformational change to happen: when Nup93 binds Nup53, the contact surface between Nup53 and Nup155 is optimized and, in this context, Nup93 can localize to the nascent pore and further recruits the Nup-62 complex.

Der Zellkern umschließt das genetische Material der Zelle. Kontakt und Austausch zwischen den nuklearen und zytoplasmatischen Kompartimenten werden durch Kernporenkomplexe (NPCs) vermittelt. NPCs sind riesige multimere Proteinkomplexe, die in die Kernhülle integriert sind. Dafür müssen sich NPCs präzise und wohl-geordnet zu transportkompetenten Komplexe aufbauen. Die Bildung der Poren erfolgt in zwei verschiedenen Stadien des Zellzyklus: in der Interphase und nach der Mitose. Während diesen Stadien werden die Poren wahrscheinlich aufgrund morphologischer Unterschiede der Zellarchitektur auf unterschiedlichen Wegen zusammengebaut. Ein tieferes Verständnis des Mechanismus der Interaktion von NPC-bildenden Faktoren könnte dazu beitragen, einen der größten und komplexesten zellulären Vorgänge zu entschlüsseln. Im Laufe meiner Promotion analysierte ich Interaktionen und die geordnete Rekrutierung von Kernporenproteinen. In-vitro-Zusammenbau des Zellkerns unter Verwendung von Xenopus-Eiextrakten ergab, dass eine Komponente der NPCs, das Kernporenprotein Nup50, in den frühen Stadien der postmitotischen NPC-Bildung erforderlich ist. Nup50 ist ein kleines nukleoplasmatisches Kernporenprotein, von dem bekannt ist, dass es für den Kernimport erforderlich ist. Ich habe zwei verschiedene Stellen in Nup50 identifiziert, die zusammen für die postmitotische Funktion wichtig sind. Beide Stellen sind entbehrlich, wenn die andere funktional ist, aber erforderlich, wenn die jeweils andere Stelle mutiert oder kompromittiert ist. Ich konnte außerdem zeigen, dass Nup50 den Initiator des NPC-Aufbaus, MEL28 / ELYS, bindet, aber diese Interaktion nicht für die postmitotische NPC-Bildung erforderlich ist. Darüber hinaus habe ich die Rolle der Domänen des Kernporenproteins Nup155 erforscht. Nup155 ist ein membranbindendes Protein, das für die postmitotische NPC-Bildung in einem späteren Schritt als Nup50 erforderlich ist. Es enthält eine N-terminale Domäne, die als beta-Propeller in ihrer Tertiärstruktur angeordnet ist, und eine C-terminale Domäne, die sich als alfa-Solenoid faltet. Durch Depletion von Nup155 können Xenopus-Eiextrakte in vitro nicht mehr Kernporenkomplexe und eine geschlossenen Kernhülle bilden. Nup155 enthält eine membranbindende Region innenhalb ihres N-Terminals. In-Vitro-Zellkernrekonstitutionen unter Verwendung von Xenopus-Eiextrakten zeigen, dass diese Membranbindungsaktivität am Ende der Mitose erforderlich ist, da eine Mutante des Nup155 Proteins, die nicht mehr an Membranen binden kann, nicht in der Lage war, das endogene Protein in Nup155-depletierten Extrakten zu ersetzen. Allerdings war das Hinzufügen von Nup155, welches am C-Terminus gekürzt wurde, in der Lage, die Kernhülle wiederherzustellen, aber nicht den Kernporenkomplex zu bilden. Diese Arbeit zeigt weiter, dass Nup155 in Lösung in einer geschlossenen Konformation gefunden werden kann. Die Bindungsstelle für Nup53 befindet sich am N-Terminus, ist aber teilweise durch den C-Terminus blockiert, was den optimalen Oberflächenkontakt der beiden Proteine verhindert. Nup93 ist erforderlich für die Konformationsänderung: Wenn Nup93 Nup53 bindet, wird die Kontaktfläche zwischen Nup53 und Nup155 optimiert und in diesem Zusammenhang kann sich Nup93 an die naszierenden Pore lokalisieren und den Nup-62-Komplex rekrutieren.