Funktionelle Analyse der Entwicklung der HCMV-Virostatikaresistenz durch die Generierung und Charakterisierung definierter HCMV Mutanten

Abstract

Eine Infektion mit humanem Cytomegalovirus (HCMV) verläuft bei immunkompetenten Patienten trotz lebenslanger Latenz meist inapparent. Bei immunsupprimierten Patienten jedoch kann eine Primärinfektion oder eine Virusreaktivierung zu schwerwiegenden Verläufen führen. Die Resistenzentwicklung von HCMV gegen die zugelassenen Virostatika Ganciclovir (GCV), Cidofovir (CDV) und Foscarnet (PFA) ist für die Therapie und den klinischen Verlauf von entscheidender Bedeutung. Molekulare Grundlage der Resistenzentwicklung sind Punktmutationen oder Deletionen im viralen DNA-Polymerasegen UL54 und im viralen Phosphotransferasegen UL97. Im Falle eines Therapieversagens ist es wichtig, den Phänotyp nachgewiesener Mutationen zu kennen, damit eine adäquate Therapieanpassung erfolgen kann. Aus diesem Grund ist es notwendig, dass neu detektierte Mutationen mittel Marker Transfer Analyse phänotypisch charakterisiert werden. Nur so ist es möglich, zwischen resistenzvermittelnden Mutationen und Polymorphismen zu unterscheiden. Am Institut für Medizinische Virologie und Epidemiologie der Viruskrankheiten, Tübingen wurden die UL97-Mutationen P468Q und A619V identifiziert, welche von resistenten HCMV-Isolaten stammten. Diese Mutationen wurden in dieser Arbeit mittels Marker Transfer Analyse untersucht. Weiterhin zeigte sich bei der Untersuchung von HCMV-Isolaten in einigen Fällen eine phänotypische GCV-Resistenz, ohne das eine korrespondierende Mutation in UL97 oder UL54 nachgewiesen werden konnte. Auf Grund der unklaren Rolle der viralen Gene UL27 und UL44 bei der Resistenzentwicklung sollten diese bei den entsprechenden HCMV-Isolaten sequenziert werden, da die Genprodukte von UL27 und UL44 mit der viralen Phosphotransferase oder der viralen DNA-Polymerase interagieren. Noch unbeschriebene Mutationen in UL27 und UL44 sollten mittels Marker Transfer Analyse charakterisiert werden. Mittels Sequenzanalyse konnten für die HCMV-Isolate die UL27-Mutationen Q14K, A20D, L133I, S173I, A184V, V310A, A558D, InsT28, DelG1564 und DelT1589 identifiziert werden. Für UL44 zeigten sich die Mutationen InsC8, InsA12, InsT23 und R6G/InsT23. Durch Marker Transfer Analyse sollten die UL27-Mutationen 77 InsT28, A20D, A184V und A558D, sowie die UL44-Mutationen InsC8, InsA12, R6G, InsT23 und R6G/InsT23 phänotypisch charakterisiert werden. Die Generierung rekombinanter HCMV-Stämme mit definierten Punktmutationen erfolgte durch en-passant-Mutagenese (Tischer et al.; 2010, 2006). Mit dieser Methode wurden die gewünschten Mutationen in ein HCMV-Referenzgenom eingebracht. Dieses lag als bacterial artificial chromosome (BAC) in E.coli GS1783 vor. Die Mutagenese mit Rekonstitution rekombinantem Virus in Zellkultur war für die UL27-Mutationen A20D, A184V und A558D, sowie für die UL97-Mutationen P468Q und A619V erfolgreich. In Bezug auf die Wachstumskinetik zeigte sich kein signifikanter Unterschied zwischen den generierten Mutanten zum Referenzstamm. Zur phänotypischen Resistenztestung wurde ein Co-Kultur Plaque-Reduktionsassay verwendet. Die UL97-Mutationen P468Q und A619V zeigten sich suszeptibel gegenüber GCV (Fischer et al.; 2016). Die UL27-Mutationen A20D, A184V und A558D zeigten sich sensitiv gegenüber GCV, CDV und PFA. Somit sind die in dieser Arbeit charakterisierten Mutationen in klinischen HCMV-Isolaten als Polymorphismen einzustufen.