Characterization of small RNAs and differential chromatin amplification in the germline of the parasitic nematode family Strongyloididae

Abstract

The two nematode sister-genera Strongyloides and Parastrongyloides form the Strongyloididae family of nematodes. This nematode family is of particular inter- est because it contains important parasites of medical and veterinary relevance. Species of this family have a complex biphasic life-cycle, which has the advantage of alternating easily accessible, sexually reproducing free-living generations with parasitic generations. Therefore, the Strongyloididae offer unique opportunies to investigate not only the evolution and basic biology of these intestinal parasites, but also to investigate antihelminthic treatments. In this thesis I am presenting the results of my work on three Strongyloididae species: S. ratti (infecting rats), S. papillosus (infecting sheep) and P. trichosuri (infecting Australian possums). I worked on two main aspects of the Strongyloididae biology: 1.) Together with colleagues, I investigated differential chromatin amplification in the gonads and compared the chromosomal content of sperm of three Strongyloi- didae species. We could show that autosomes are present in higher copy numbers than X chromosomes in a population of giant nuclei with a very high DNA con- tent, located in the distal parts of the gonads of free-living adults of all three species. Quantitative RNA sequencing showed that autosomal genes are higher expressed than X chromosomal ones in these cells, implying that differential chro- matin amplification serves as a mechanism for the regulation of gene expression. Further we showed that S. ratti, but not S. papillosus, produces genetically male determining (nullo-X) sperm, although the free-living generations of both species do not produce any surviving male progeny. 2.) I sequenced and analyzed the small RNA classes of two different developmen- tal stages of the three Strongyloididae. For comparison, I also re-sequenced the sRNAs of the two free-living model nematodes Caenorhabditis elegans and Pris- tionchus pacificus. Recent studies had shown considerable variation in the sRNAs among nematodes, but no Strongyloididae species or close relative had been in- cluded in these studies. Therefore, I established a sRNA sequencing protocol. I identified conserved and taxon specific micro RNAs of which many are differen- tially regulated between the stages. I found that Strongyloididae have lost the highly conserved class of piRNAs, but possess a novel class of ∼27 nucleotide long RNAs, starting with 5’G or A. These 27GA RNAs appear to have triphosphates at their 5’ ends and are therefore presumably synthesized by RNA dependent RNA polymerases without 5’ processing. The 27GA RNAs have the potential to target transposable elements and endogenous genes. Finally, I showed that no parasite- derived sRNAs circulate in the blood of S. ratti -infected rats at detectable levels.

Die zwei Schwestergattungen Strongyloides und Parastrongyloides repräsentieren die Nematodenfamilie Strongyloididae. Diese Nemtodenfamilie ist von beson- derem Interesse, da sie wichtige Parasiten von human- und tiermedizinischer Rel- evanz enthält. Spezies dieser Familie haben einen biphasischen Lebenszyklus, der den Vorteil hat, dass sich einfach zu handhabende, sexuell reproduzierende und freilebende Generationen mit eher schwierig zu handhabenden parasitischen Generationen abwechseln. Daher bieten die Strongyloididae Arten einzigartige Möglichkeiten, nicht nur zur Untersuchung der Evolution und Grundlagenbiologie dieser Darmparasiten, sondern sie ermöglichen auch die Erforschung von Anti- helminthika. Meine Arbeit konzentriert sich auf zwei Aspekte der Biologie der Strongyloididae Arten S. ratti (infiziert Ratten), S. papillosus (infiziert Schafe) and P. trichosuri (infiziert australische Possums): 1.) Gemeinsam mit Kollegen habe ich die differentielle Amplifizierung von Chro- matin in den Gonaden von drei Strongyloididae Arten untersucht und habe den chromosomalen Inhalt ihrer Spermien spezifiziert. Wir konnten zeigen, dass in der Keimbahn dieser Würmer, speziell den sogenannten “giant nuclei”, Auto- some in höherer Kopienzahl als X Chromosome vorliegen. Durch quantitative RNA Sequenzierung konnten wir zusätzlich zeigen, dass auotosmale Gene höher exprimiert sind als X-chromosomale Gene, was darauf hindeutet, dass die differen- tielle Chromatin Amplifikation dem Zweck dient, die Genexpression zu regulieren. Weiterhin haben wir gezeigt, dass S. ratti, aber nicht S. papillosus, männchen- produzierende (nullo-X) Spermien produziert, obwohl keine der beiden Spezies überlebende männlichen Nachkommen in der freilebenden Generation zeugt. 2.) Ich habe kleine RNA Klassen in zwei Entwicklungsstadien der Strongyloididae sequenziert und analysiert. Zum Vergleich habe ich die kleinen RNAs der freileben- den Modellnematoden, C. elegans und P. pacificus, resequenziert. Neueste Studien haben gezeigt, dass nicht-kodierende, kleine RNA Klassen innerhalb der Nemato- den stark variieren, jedoch war keine Strongyloididae Art Teil dieser Studien. Da- her habe ich ein Protokoll für die sRNA Sequenzierung etabliert und konservierte und taxonspezifische micro RNAs identifiziert, von denen viele zwischen den Sta- dien differentiell exprimiert sind. Ich habe herausgefunden, dass die ansonsten hochkonservierte Klasse der piRNAs nicht vorhanden ist, dafür aber eine neue Klasse an sRNAs, mit einer Länge von ∼27 Nukleotiden und 5’G oder A. Diese 27GA RNAs scheinen Triphosphate an ihren 5’ Enden zu haben und werden da- her mutmaßlich von RNA abhängigen RNA Polymerasen synthetisiert. Die 27GA RNAs haben das Potential Transposons und Gene zu regulieren und können damit möglicherweise den Verlust der piRNAs kompensieren. Abschließend konnte ich keine zirkulierenden parasitischen sRNAs im Blut von Wirten nachweisen.