Functional analysis of the membrane-fusion machinery mediating cell-plate formation in dividing cells of the flowering plant Arabidopsis thaliana

Abstract

The mechanism of plant cytokinesis strongly differs from cell division in other eukaryotic organisms. The expanding cell plate grows from the centre of the division plane towards the maternal plasma membrane. The formation of this vesicular-tubular network is arranged through the delivery of large amounts of membrane vesicles, which fuse with one another in the division plane and requires the activity of SNARE proteins and regulatory proteins that belong to the Sec1/Munc18 family (SM). The SM protein KEULE functions in Arabidopsis cell division through the positive regulation of the cytokinesis-specific Qa-SNARE KNOLLE and its Qb-, Qc- (or Qbc-) R-SNARE partners. It was so far unknown, in which form interacting SNAREs traffic through the endomembrane system and reach their destination at the cell plate, whether as monomeric SNAREs or in pre-assembled, inactive complexes. This issue was addressed in several specifically engineered lines of specifically engineered transgenic Arabidopsis seedlings. In these seedlings, traffic could be blocked at different sites along the secretory trafficking pathway by applying the fungal toxin brefeldin A (BFA). The interaction and complex formation of newly synthesised SNARE proteins was than evaluated in such treated seedlings and the transport form extrapolated from the observed state of these SNARE proteins. The essential function of the SM protein KEULE becomes evident in keule mutants, in a severely impaired cellular morphology and a developmental arrest at an early seedling stage. However, this late developmental arrest also indicates the presence of an active membrane fusion machinery that promotes cell division during earlier developmental stages. Arabidopsis and most other angiosperms encode for three SEC1-related SM proteins. SEC1B, the closest homologue of KEULE in Arabidopsis, was functionally analysed and its function evaluated for overlapping and/or specialized roles compared to that of KEULE. The R-SNAREs VAMP721 and VAMP722 equally contribute to vesicle fusion during cell plate formation as part of previously described cytokinesis-specific SNARE complexes in Arabidopsis. However, even in the absence of both proteins in vamp721 vamp722 double mutants, cell division is not entirely abolished during earlier developmental stages. Therefore, the involvement of further R-SNAREs can be hypothesised. The VAMP72 clade in Arabidopsis contains beside VAMP721 and VAMP722 five more members, among which only VAMP724 is expressed during vegetative plant growth, localizes to the plasma membrane and is not yet fully characterized. Thus, VAMP724 was functionally analysed as candidate for an overlapping function with VAMP721 and VAMP722 in membrane fusion during cytokinesis.

Der Mechanismus der Zellteilung in Pflanzen unterscheidet sich grundlegend von dem anderer eukaryotischer Organismen. Es entsteht eine Zellplatte, die vom Zentrum der Zellteilungsebene aus in Richtung der parentalen Plasmamembran expandiert, mit der sie fusioniert und dadurch die Tochterzellen voneinander separiert. Dafür werden Membranvesikel zunächst ins Zentrum und später entsprechend an die Ränder des expandierenden tubolo-vesikulären Netzwerks der wachsenden Zellplatte geliefert, wo sie miteinander und mit der Zellplatte fusionieren. Da die Zellplatte etwa ein Drittel der parentalen Plasmamembran umfasst, werden große Mengen an Membranvesikeln benötigt um die separierende Membran auszubilden. Proteine der SNARE und der SEC1/Munc18 (SM) Familie spielen bei der Fusion von Membranen eine essenzielle Rolle. Das SM-Protein KEULE fungiert während der Zellteilung in Arabidopsis als positiver Regulator des Qa-SNAREs KNOLLE. Bislang war es nicht bekannt, in welcher Form KNOLLE und SNARE Partner durch das Endomembransystem transportiert werden, ob als monomere Proteine oder als assemblierter Komplex, der inaktiv gehalten werden muss. Um dies zu analysieren, wurden verschiedene transgene Linien generiert, in denen der sekretorische Transportweg an unterschiedlichen Stellen blockiert werden konnte, durch die Behandlung mit dem pilzlichen Inhibitor Brefeldin A (BFA). In behandelten Keimlingen wurde die Interaktion und damit, die Ausbildung von SNARE Komplexen für neugebildeten SNARE Proteine analysiert und daraus die Transportform entsprechenden extrapoliert. Das SM Protein KEULE spielt eine essentielle Rolle während der Zellteilung in Arabidopsis, indem es das Qa-SNARE KNOLLE positiv reguliert. Interessanterweise blockiert jedoch der Ausfall von KEULE nicht die weitere Embryonalentwicklung, wie bei einem Ausfall der Zellteilung zu erwarten wäre. Arabidopsis und die meisten anderen Angiospermen kodieren für zwei SEC1-ähnliche SM Proteine, neben KEULE. Unter ihnen ist SEC1B das am nächsten verwandte Protein zu KEULE. Daher wurde SEC1B funktional charakterisiert und auf überlappende und spezialisierte Rollen gegenüber KEULE, in der Pflanzenentwicklung evaluiert. Die R-SNAREs VAMP721 und VAMP722 sind gleichermaßen beteiligt an der Vesikelfusion an der Zellplatte. Jedoch ist die Zellteilung in vamp721 vamp722 Doppelmutanten nicht komplett inhibiert, was auf funktionell überlappende R-SNAREs hinweist. VAMP721/VAMP722 gehören zur VAMP72 Familie, die sieben Mitglieder in Arabidopsis beinhaltet. Unter ihnen ist VAMP724 das einzige Mitglied, dem bislang keine spezifische Funktion zugewiesen wurde, das an der Plasmamembran lokalisiert und das in relevanten, vegetativen Entwicklungsphasen exprimiert wird. Daher wurde VAMP724 funktional charakterisiert und auf eine überlappende Rolle mit VAMP721 und VAMP722 in der Vesikelfusion während der Zellteilung analysiert.