Nanofluidic technology for chemical neurostimulation

Abstract

The goal of this work was to develop technology for local chemical stimulation of neurons. Recent years have seen impressive treatment of neurodegenerative diseases by electrical neuroprostheses, including restoration of vision by retinal implants. Despite their success, these prostheses interact by unnatural mechanisms of electrical neurostimulation, which cannot fully mimic biological specificity or resolution. Stimulation by artificial chemical signals could provide a more natural means of restoring neurological functions, but technology for precise, high-resolution chemical release remains primitive in comparison with microelectronics. Current micro- or nanofluidic technology cannot control chemical release with sufficient precision to imitate synaptic release.

This work has focused on two main topics. First, the investigation of hydrophobically gated nanopores has been pursued towards developing precise nanovalves for absolute, diffusion-free control of chemical release. Second, a platform for in vitro chemical stimulation of cells or tissues by chemical release from nanopores integrated with microfluidic control and microelectrodes has been developed. In support of these topics, issues of nanofluidic chemical control and future chemical neuroprostheses have been investigated.

Hydrophobically gated nanopores may provide ideal control for high-resolution chemical release, but previous reports in artificial nanopores suffered from limited reversibility and reproducibility. These challenges were compounded by limited understanding of the physical mechanisms governing the observed behaviour. Extensive literature review was carried out to understand the liquid–vapour behaviour in artificial hydrophobic nanopores. The contributing mechanisms are distinct from hydrophobic gating in biological nanopores with dimensions an order of magnitude smaller. Electrowetting – more specifically, electromechanical force on the liquid–vapour surface – was identified as the principal mechanism. Models of electrowetting in nanopores were developed, including for nanopores with integrated gate electrodes for individual control of nanopores in contact with a shared reservoir. Because reversibility of hydrophobic gating in large hydrophobic nanopores requires trapped bubbles, a novel mechanism was proposed to trap bubbles in circumferential cavities within nanopores. Hydrophobic gating behaviour was investigated by current–voltage recordings of silicon nitride (SiN_x) nanopores modified with monofunctional hydrophobic silanes and gold nanopores modified with hydrophobic thiols. Differences observed in SiN_x–silane and gold–thiol nanopores demonstrated the importance of material selection for precise, stable nanopore fabrication, and suggested that molecular effects contribute to electrowetting behaviour. Limited stability of thiol-coated gold prevented investigation of electrowetting by integrated electrodes. Through analysis of theoretical and experimental results, next experiments towards reversible hydrophobic gating were proposed.

A nanopore-based in vitro chemical stimulation platform was developed for biological experiments with localized chemical release. A nanopore/microelectrode array (NPMEA) was produced based on established microelectrode arrays (MEAs). MEAs are widely used for in vitro neuroscience research, and established systems for cell culture and tissue preparations can be transferred to the NPMEA. Although many microfluidic platforms for chemical stimulation of cells have been reported, none have reached submicrometre dimensions. Integrating nanofluidic structures introduced unique challenges, but also opened new possibilities for nanofluidic control of chemical release. The NPMEA integrated focused-ion-beam-milled nanopores by dry bonding with microfluidic channels produced by photolithography. The process was designed to ensure future compatibility with alternative nanopore designs, such as hydrophobically gated nanopores. The resulting NPMEA has 29 microelectrodes for electrophysiological recording and stimulation, and 30 nanopores individually addressed by microfluidic channels and electrodes. A robust microfluidic connector was produced to connect the 30 microfluidic channels, which surpassed the complexity of many microfluidic applications. The NPMEA was applied in first biological experiments towards proof of local nanopore-based chemical stimulation, but a positive demonstration has not yet been obtained.

This work presents concrete steps towards precise, high-resolution chemical stimulation of neurons. Challenges remain before hydrophobically gated nanopores may be achieved, and nanopore-based chemical release from the developed in vitro system must be verified with biological experiments. The path towards chemical neuroprostheses extends far into the future, but the continuation of this work will be moving in the right direction.

Ziel dieser Arbeit war es, Technologien für die lokale chemische Stimulation von Neuronen zu entwickeln. In den letzten Jahren entstanden beeindruckende Behandlungsmöglichkeiten für neurodegenerative Krankheiten durch elektrische Neuroprothesen, einschließlich der Wiederherstellung des Sehvermögens durch Netzhautimplantate. Trotz ihres Erfolgs interagieren diese Prothesen durch den an sich unnatürlichen Mechanismus der elektrischen Neurostimulation, der Spezifität und Auflösung des biologischen Vorbilds nicht vollständig nachahmen kann. Die Stimulation durch chemische Signale appliziert durch künstliche Systeme könnte einen physiologischeren Weg zur Wiederherstellung neurologischer Funktionen eröffnen. Bisher allerdings sind die für eine präzise, hochauflösende chemische Freisetzung verfügbaren Technologien im Vergleich zur Mikroelektronik nicht hinreichend weit entwickelt. Die aktuell verfügbare Mikro- oder Nanofluidik-Technologie kann die Freisetzung chemischer Stoffe nicht mit ausreichender Genauigkeit steuern, um synaptische Transmitterfreisetzung angemessen zu imitieren.

Diese Arbeit konzentrierte sich auf zwei Hauptthemen. Zum einen wurden Untersuchungen zu hydrophob schaltbaren Nanoporen unternommen, um präzise Nanoventile für die leckage- und diffusionsfreie Kontrolle der Freisetzung chemischer Stoffe zu entwickeln. Zum anderen wurde eine Testplattform entwickelt, welche Nanoporen mit Mikrofluidik und Mikroelektroden integriert, um die chemische Stimulation von Zellen oder Geweben durch die Freisetzung chemischer Stoffe aus Nanoporen zu testen. Zusätzlich wurden Aspekte zur nanofluidischen, chemischen Steuerung und zu zukünftigen chemischen Neuroprothesen diskutiert.

Hydrophob geschaltete Nanoporen sind ideale Kandidaten für die Steuerung räumlich hochauflösender Freisetzung chemischer Stoffe, jedoch zeigten bisherige Berichte über künstliche Nanoporen deutliche Mängel hinsichtlich der Reversibilität und Reproduzierbarkeit des Schaltverhaltens. Dies ist auf das bislang begrenzte Verständnis der diesen Phänomenen zugrunde liegenden physikalischen Mechanismen zurückzuführen. Eine umfangreiche Literaturrecherche wurde durchgeführt, um das Flüssigkeit-Dampf-Verhalten in künstlichen, hydrophoben Nanoporen zu verstehen. Die dort auftretenden Mechanismen unterscheiden sich grundsätzlich von den Verhältnissen in biologischen Nanoporen, die zwar ebenfalls mittels hydrophobem Schalten funktionieren, jedoch um eine Größenordnung kleiner sind. Als Hauptmechanismus wurde die Elektrobenetzung (im Englischen „electrowetting“) – genauer gesagt die auf die Flüssigkeits-Dampf-Grenzfläche wirkende elektromechanische Kraft – identifiziert. Es wurden verschiedene Modelle der Elektrobenetzung in Nanoporen entwickelt, darunter eines für Nanoporen mit integrierten Gate-Elektroden zur individuellen Steuerung von Nanoporen in Kontakt mit einem gemeinsamen Reservoir. Da in großen hydrophoben Nanoporen das permanente Vorhandensein von Gasblasen notwendig ist, um die Reversibilität des hydrophoben Schaltens sicherzustellen, wurde ein neuer Mechanismus vorgeschlagen, bei dem solche Gasblasen in umlaufenden Hohlräumen der Nanopore gehalten werden. Das fluidische Schaltverhalten der hydrophoben Nanoporen wurde mit Hilfe von Strom-Spannungs-Messungen untersucht. Diese Nanoporen bestanden entweder aus Siliziumnitrid (SiN_x) modifiziert mit monofunktionellem Silan oder aus Gold modifiziert mit Thiol. Die in SiN_x–Silan- und Gold–Thiol-Nanoporen beobachteten Unterschiede unterstreichen die Bedeutung der Materialauswahl für die präzise, stabile Nanoporen-Herstellung und zeigten, dass molekulare Effekte das Elektrobenetzungsverhalten beeinflussen. Die begrenzte Beständigkeit des Thiol-beschichteten Goldes verhinderte weitere Untersuchungen an Nanoporen mit integrierten Elektroden. Auf der Grundlage der theoretischen und experimentellen Ergebnisse werden weiterführende Experimente zum reversiblen, hydrophoben Schalten vorgeschlagen.

Eine Nanoporen-basierte in vitro Stimulationsplattform wurde entwickelt, um Zellen und Gewebe mittels lokaler Freisetzung chemischer Stoffe zu stimulieren. Ein Nanoporen/Mikroelektroden-Array (NPMEA) wurde basierend auf etablierten Mikroelektroden-Arrays (MEAs) hergestellt. MEAs sind weit verbreitet in der neurowissenschaftlichen in vitro Forschung und etablierte Kultivierungsverfahren für Zellen und Gewebepräparate können auf NP-MEAs übertragen werden. Obwohl bereits viele mikrofluidische Plattformen für die chemische Stimulation von Zellen beschrieben wurden, wies keines davon Dimensionen kleiner als 1 µm auf. Die Integration nanofluidischer Strukturen stellt eine sehr hohe technologische Herausforderung dar, eröffnet aber auch neue Möglichkeiten der nanofluidischen Kontrolle der Freisetzung chemischer Stoffe. Das NPMEA integriert mittels fokussiertem Ionenstrahl erzeugte Nanoporen mit photolithographisch hergestellten mikrofluidischen Kanälen mit Hilfe eines Trockenverklebungsverfahrens. Dieses Verfahren wurde entwickelt, um die zukünftige Kompatibilität der Technologie mit alternativen Nanoporen – zum Beispiel mit hydrophobem Schalten – sicherzustellen. Das resultierende NPMEA hat 29 Mikroelektroden zur elektrophysiologischen Aufzeichnung und Stimulation und 30 Nanoporen, die einzeln durch mikrofluidische Kanäle und Elektroden adressiert werden. Ein robuster mikrofluidischer Aufbau wurde entwickelt, der es ermöglicht, simultan 30 mikrofluidischen Kanäle mit der Peripherie zu verbinden, was hinsichtlich Komplexität viele bisherige mikrofluidische Anwendungen deutlich übertrifft. Das NPMEA wurde in ersten biologischen Experimenten zur lokalen Nanoporen-basierten chemischen Stimulation eingesetzt, ein positiver Nachweis wurde jedoch noch nicht erzielt.

Diese Arbeit verbindet eine systematische Analyse der physikalischen Grundlagen schaltbarer nanofluidischer Poren mit konkreten technologischen Schritten für ihre Realisierung, mit dem Ziel der präzisen, hochauflösenden und chemischen Stimulation von Neuronen. Allerdings bleibt die Herausforderung, zuverlässig und reproduzierbar hydrophob geschalteter Nanoporen bestehen und die Nanoporen-basierte Freisetzung chemischer Stoffe aus dem entwickelten in vitro System muss mit weiteren biologischen Experimenten überprüft werden. Der Weg zu chemischen Neuroprothesen reicht sicherlich noch weit in die Zukunft, diese Arbeit hat jedoch wichtige Grundlagen dafür gelegt.