Inhaltszusammenfassung:
Der mikrobielle Sekundärmetabolismus ist eine reichhaltige Quelle für Naturstoffe, von denen viele klinische beziehungsweise industrielle Anwendung gefunden haben. Die Gattung Amycolatopsis ist für die Synthese vieler Naturstoffe bekannt. Beispielsweise werden viele Glykopeptid-Antibiotika, wie das klinisch relevante Vancomycin oder das Balhimycin, von Stämmen dieser Gattung produziert. Im Gegensatz dazu wurde der Stamm Amycolatopsis japonicum nie als Produzent einer biologisch aktiven Substanz beschrieben. Dieser Stamm produziert jedoch unter Zinkmangelbedingungen das EDTA-Isomer Ethylendiamindisuccinat ([S,S]-EDDS). Diese zinkabhängige [S,S]-EDDS Produktion lässt darauf schließen, dass [S,S]-EDDS ein Zinkophor ist, das an der Zinkaufnahme beteiligt ist.
[S,S]-EDDS weist Komplexbildungseigenschaften auf, die mit denen von EDTA vergleichbar sind. Im Gegensatz zu EDTA ist [S,S]-EDDS jedoch biologisch abbaubar. Die weite industrielle Anwendung von EDTA in Kombination mit dessen Unzugänglichkeit für biologische Abbauprozesse führt zu einer umweltgefährdenden EDTA-Persistenz in aquatischen Lebensräumen. Der Naturstoff [S,S]-EDDS ist deshalb ein nachhaltiger EDTA Ersatz mit einem verbesserten ökologischen Fingerabdruck.
In dieser Arbeit wurden zwei molekulargenetische Strategien entwickelt, um die Biosynthese des Glykopeptid-Antibiotikums Ristomycin A zu aktivieren und um die [S,S]-EDDS-Biosynthese-Gene in
A. japonicum zu identifizieren.
Untersuchungen des genetischen Potenzials der Gattung Amycolatopsis ließen vermuten, dass auch A. japonicum die Fähigkeit besitzt, ein Glykopeptid-Antibiotikum zu synthetisieren. Um dieses nicht exprimierte, sogenannte „stille Gencluster“ zu aktivieren, wurde ein molekulargenetischer Ansatz verwendet, bei dem der Biosynthese-spezifische Aktivator Bbr heterolog in A. japonicum exprimiert wurde. Bbr reguliert die Balhimycin-Biosynthese in Amycolatopsis balhimycina. In A. japonicum induzierte dessen Expression die Produktion von Ristomycin A, was durch HPLC-DAD, MS, MS/MS, HR-MS, und NMR-Analysen bestätigt werden konnte. Ristomycn A ist ein vielfach glykosyliertes Heptapeptid, das als Hauptwirkstoff in Diagnoseverfahren zur Bestimmung von angeborenen und weitverbreiteten Blutgerinnungsstörungen verwendet wird. Die Sequenzierung des A. japonicum Genoms und dessen computergestützte Auswertung führten zur Identifizierung des Biosynthese-Genclusters, das für die Synthese von Ristomycin A verantwortlich ist.
Solche computergestützten Genomanalysen mittels verschiedenster bioinformatischen Plattformen werden heutzutage standardmäßig zur Identifizierung von Sekundärmetabolit-Gencluster angewandt, die bekannten Synthesemechanismen zugeordnet werden können. Allerdings konnten die [S,S]-EDDS-Biosynthese-Gene mit diesen Tools nicht entdeckt werden, was auf einen bislang nicht bekannten Biosynthesemechanismus hindeutet. Um diesen zu identifizieren, wurde ein neuer Ansatz entwickelt, der auf der Annahme beruht, dass die Zink-reprimierte [S,S]-EDDS-Biosynthese durch einen Zink-sensitiven Regulator gewährleistet wird. Die bakterielle Zink-Homöostase wird meistens durch den globalen Zink-spezifische Transkriptionsregulator Zur reguliert. Das Zur Protein von A. japonicum wurde identifiziert und detailliert charakterisiert. Es konnten gezeigt werden, dass ZurAj die Transkription des hoch affinen Zinkaufnahmesystems ZnuABCAj durch seine Zink-abhängige Bindung an spezifische DNA Bindesequenzen reguliert. Diese Zur-Bindesequenzen wurden verwendet, um das A. japonicum Genom nach weiteren, ZurAj regulierten, Genen zu durchsuchen. Dies führte zur Auffindung des aesA-D Operons. Umfangreiche Transkriptions-Untersuchungen ergaben, dass aesA-D Zink-abhängig von ZurAj reguliert wird. Die Beteiligung von aesA-D an der [S,S]-EDDS konnte durch Inaktivierungsversuche nachgewiesen werden. Zusätzlich führte die Deletion des Zinkregulators ZurAj (A. japonicum Δzur) dazu, dass auch in Gegenwart von hohen Zink-Konzentrationen [S,S]-EDDS in hohen Mengen produziert wird.
A. japonicum Δzur ist eine erfolgversprechende Ausgangsbasis, um einen nachhaltigen und wirtschaftlich verwertbaren [S,S]-EDDS Produktionsprozess zu entwickeln, der keiner Limitierung durch negative Einflüsse von Zink unterliegt.
Die Strategie, ein vorhergesagtes, stilles Gencluster durch die Expression eines spezifischen Regulators zu aktivieren, sowie auch die Strategie, neue Biosynthese-Gene durch die Charakterisierung eines globalen Regulators, der spezifische Umweltsignale wahrnimmt, zu identifizieren, ermöglichte die Charakterisierung neuer Naturstoffsynthesewege in A. japonicum. Beide Ansätze nutzen Erkenntnisse über regulatorische Mechanismen und besitzen das Potenzial zukünftig angewendet zu werden, um neue Naturstoffe und neue Synthesewege zu identifizieren.
Abstract:
The microbial secondary metabolism is a rich source for valuable products that have found their way into various clinical and industrial applications. A particularly productive bacterial genus for the discovery of natural products is Amycolatopsis. The most frequently reported type of secondary metabolites produced by this genus, are glycopeptide antibiotics like balhimycin or the medically relevant vancomycin. In contrast to most other members of the Amycolatopsis genus, Amycolatopsis japonicum was never described to produce any product with antibacterial activity. This strain however is known to synthesize the chelating agent ethylenediamine-disuccinate ([S,S]-EDDS), a biodegradable EDTA isomer in response to zinc deficiency. This zinc responsive repression of [S,S]-EDDS production indicates that it contributes to zinc uptake and that it belongs to the rarely described physiological group of the zincophores. Combining excellent chelating properties with the accessibility to biodegradation, [S,S]-EDDS is considered as a sustainable chelating agent, possessing the potential to replace EDTA and other environmentally threatening chelating agents in various applications.
In this study, two distinct molecular genetic strategies were developed and implemented to activate the biosynthesis of the glycopeptide antibiotic ristomycin A or to identify the [S,S]-EDDS biosynthetic genes in Amycolatopsis japonicum, respectively.
Genetic evaluation of the Amycolatopsis antibiotic biosynthetic potential indicated that A. japonicum might has the capability to produce a glycopeptide antibiotic. Since the biosynthesis of the predicted glycopeptide was not inducible by variations in culture conditions, a molecular genetic approach was employed to activate its production. Heterologous expression of the characterized pathway specific activator Bbr, naturally inducing the balhimycin biosynthesis in A. balhimycina, also induced the synthesis of a bioactive substance by A. japonicum. The bioactivity could be assigned to the production of ristomycin A, a highly glycosylated peptide antibiotic which is used as compound in diagnostic kits to detect widespread hereditary coagulation disorders. Full sequencing of the A. japonicum genome and its computational analysis led to the identification of the corresponding biosynthetic gene cluster which is directing the biosynthesis of ristomycin A.
Such computational genome analyses by various bioinformatic tools are nowadays standardized applied strategies to identify secondary metabolite gene clusters. These approaches however failed in the identification of the [S,S]-EDDS biosynthetic genes. This required the development of a new approach which relies on the assumption that the zinc repressed biosynthesis of [S,S]-EDDS is regulated by a zinc responsive regulatory element. Therefore, the major zinc responsive transcriptional regulator of A. japonicum (Zur) was characterized in detail. Zur regulates the expression of the high affinity zinc uptake system ZnuABC by binding to a specific DNA binding sequence. The screening of the A. japonicum genome for further Zur regulated genes by using this deduced Zur binding sequence led to the identification of the operon aesA-D. Extensive transcriptional analyses and band shift assays revealed that aesA-D is zinc responsively regulated by Zur and involved in [S,S]-EDDS biosynthesis, as shown by inactivation studies. The [S,S]-EDDS biosynthesis was uncoupled from zinc repression by deleting zur. This mutant sets the stage to establish a sustainable [S,S]-EDDS production process without limits formerly imposed by zinc repression.
The strategy to awake predicted silent gene clusters by using a characterized regulator as well as the strategy to identify new biosynthetic genes by characterizing an environmental signal-sensing regulator enabled the isolation of novel biosynthetic pathways in A. japonicum. Both approaches follow the joint concept to exploit knowledge of regulatory pathways and have the prospect to be generally applicable in order to guide future detection of new natural products.
