In vitro Differenzierung Vdelta1-positiver T-Zellen in alphabeta T-Zellen aus der alphabeta T-Zell-depletierten mononukleären Zellfraktion des Peripherblutes gesunder Spender

Abstract

Unsere Versuche zur Generierung BZLF-1 Peptidspezifischer peripherer αβ T-Zellen in einer in-vitro-Umgebung ohne Thymus, haben wir mit αβ-depletierten PBMC (Peripheral Blood Mononuclear Cell) begonnen, in denen nur noch Vδ1+ T-Zellen das T-Zell-Kompartiment stellten. Als T-Zell-Spender dienten vier gesunde HLA-B35+ Probanden im Alter von 28 bis 45 Jahren (zwei Männer, zwei Frauen). HLA-B35+ Spender wurden gewählt, da das Peptid BZLF-1, das wir wöchentlich zum Standardmedium hinzugegeben haben, HLA-B35-restringiert ist. Bei dem Peptid BZLF-1 handelt es sich um das EBV-abgeleitete HLA-B*3501-restringierte BZLF154-64 (EPLPQGQLTAY) Peptid, welches vom ELS4 TCR erkannt wird.

Die αβ-T-Zell-depletierte PBMNC Fraktion der vier unterschiedlichen Spender wurde wöchentlich mit bestrahlten autologen mononukleären Zellen des peripheren Blutes (Feeder-Zellen) der jeweiligen Spender versetzt. Im Laufe der vierwöchigen Zellkultur wurde den Zellen zudem - zusammen mit den bestrahlten Feeder-Zellen - wöchentlich ein Standard-Kulturmedium, das u.a. PHA, Il-2 und Il-7 enthielt, hinzugegeben. Während das Medium für die eine Hälfte der Ansätze BZLF-1 erhielt, wurde das Medium für die andere Hälfte nicht mit BZLF-1 versetzt (Kontrollansatz).

Im Laufe des Versuches wurde ein wöchentliches FACS-Monitoring zur Observation der αβ-T-Zell-Population durchgeführt (bis zur 4. bzw. 5. Woche) und Zellmaterial für nachfolgende RNA-Isolierungen (bis zur 4. Woche) gesammelt. Aus den gewonnen Zellmaterialien wurde die RNA isoliert und komplementäre DNA (cDNA) hergestellt. Im Anschluss erfolgte die Analyse der Proben durch Vα- und Vβ-Spectratyping. Eindeutig identifizierbare Einzelpeaks wurden sequenziert, um die spezifischen Aminosäuresequenzen der TCRα bzw. TCRβ CDR3-Regionen zu ermitteln.

Die Generierung von αβ-TCR-exprimierenden Zellen aus Vδ1+, αβ-TCR-depletierten Zellpopulationen konnte beobachtet werden. Dabei zeigte sich eine hohe interindividuelle Varianz der Anzahl der (Vδ1+-)Progenitoren und der Anzahl der αβ T-Zellen. Die native Vδ1+ CD4+ Population und die Anzahl der generierten αβ+ T-Zellen korrelieren in den Peptid-gepulsten Kulturansätzen, jedoch nicht in nicht-Peptid-gepulsten Kulturen. Interessanterweise konnten keine BZLF-1 Peptid-spezifischen T-Zellen nachgewiesen werden. Die Analyse erfolgte mit BZLF-1-Pentameren.