Dosisabhängiger Einfluss von Combretastatin A-4 auf das Wachstum humaner, aortaler, glatter Muskelzellen

Abstract

Dosisabhängiger Einfluss von Combretastatin A-4 auf das Wachstum humaner, aortaler, glatter Muskelzellen

Thema der Dissertation ist der dosisabhängige Einfluss von Combretastatin A-4 (CA-4) auf das Wachstum humaner, aortaler, glatter Muskelzellen (HASMC). Die HASMCs spielen eine besondere Rolle beim Restenosemechanismus, insbesondere nach stattgehabter percutaner transluminaler Angioplastie (PTA). CA-4 gehört zur Stoffgruppe der Combretastatine, die den Tubulin-bindenden Stoffen zugerechnet werden. Combretastatine zeigen eine strukturelle Ähnlichkeit mit Colchizin, verfügen jedoch über eine höhere Affinität zu den Colchizinbindungsstellen auf dem Tubulin als Colchizin selbst. Sie inhibieren die Mikrotubulusaktivität und verhindern somit ein Zellwachstum sowie eine Zellvermehrung.

Zur Untersuchung der wachstumshemmenden Wirkung des CA-4 wurden u.a. als methodische Mittel die Proliferationskinetik (PK), der Koloniebildungstest (KOBI = klonogene Aktivität) und die Durchflußzytometrie verwendet.

In der Proliferationskinetik wurden die HASMCs in einer Untersuchungsgruppe einmalig (Einfach-Behandlung) und in einer anderen Untersuchungsgruppe kontinuierlich (Dauer-Behandlung) nach entsprechenden Medienwechseln (MW) - jeweils alle 4 Tage und erneuter Zugabe von CA-4 - anbehandelt. Hierbei zeigte sich im Vergleich zur Kontrolle (unbehandelt) für die geringste Dosis (0.5x10-9 M, s. Abb. 3, Tab. 5 und 6) sowohl in der Einfach-Behandlung als auch Dauer-Behandlung nahezu keine inhibierenden Effekte auf das Proliferationsverhalten der HASMCs. Deutlicher erkennbar wirkte sich der inhibierende Effekt ab einer Dosis von 2.5x10-9 M (Abb. 3, Tab. 5 und 6) aus. Hier zeigte sich bereits eine merkliche Abnahme des Proliferationsverhaltens der Zellen mit flacherem Wachstumsanstieg und demzufolge niedrigeren Zellzahlen im Vergleich zur Kontrollgruppe in beiden Behandlungsformen. Der Übergang in ein Plateau, das „steady-state“ (Zellproliferation = Zelluntergang), wurde auf einem niedrigerem Zellzahlenniveau (s. Tab. 5 und 6) in beiden Behandlungsformen erreicht. Die Zellen mit der Höchstdosis 5x10-9 M (s. Abb. 3, Tab. 5 und 6) erfuhren eine erhebliche Hemmung der Proliferation. Die „Einfach-behandelten“ Zellen, zeigten nach den regelmäßigen Stopptagen mit MW, eine langsame Erholungstendenz, wenngleich auf deutlich niedrigerem Niveau. In der Gruppe der „Dauer-behandelten“ Zellen trat ein kompletter Wachstumsstopp ein (s. Tab 6) mit geradem Kurvenverlauf auf Höhe des Ausgangswert Tag 0. Der Kurvenverlauf in der Einfach-Behandlung nimmt hingegen einen erheblich flacheren, exponentiellen Verlauf (s. Abb. 3, 5x10-9 M) an mit Übergang in eine Plateauphase. Aus den Ergebnissen sowie der Erstellung des Proliferationsmodells (s. Formel, Kap. 2.5.2) läßt sich zudem eine dosisabhängige Abnahme der Zellzahl pro 1 M des CA-4 Agens ableiten. Für beide Behandlungsarten bedeutet dies pro 1 M des CA-4 Agens, Abnahme der Zellzahl um 319.000 Zellen.

Bei der Auswertung des KOBI (untersucht die Vermehrungsfähigkeit der Zellen) wies die behandelte Zellgruppe mit 5x10-10 M CA-4 (s. Abb. 4 und 5, grüne Kurve) einen nahezu identischen Kurvenverlauf zur Kontrollgruppe auf, welches sich auch in den gemittelten KOBI-Zahlen (s. Tab. 7 und 8) beider Behandlungsgruppen (Einfach- und Dauer-Behandlung) widerspiegelte. Die mit 2.5x10-9 M CA-4 „Einfach-behandelte“ Zellgruppe zeichnete sich zu Beginn durch einen leicht herabgesetzten Kurvenbeginn (s. Abb. 4, blaue Kurve 2.5) aus im Sinne einer reduzierten klonogenen Aktivität. Mit regelmäßigem MW näherte sich die 2.5x10-9 M Kurve der Kontrollgruppenkurve allmählich an, wobei erst gegen Ende der Beobachtungsperiode das Niveau der klonogenen Fähigkeit der Kontrollgruppe erreicht wird. Dieser Effekt lässt sich auch an den absoluten KOBI-Zahlen (s. Tab. 7) beobachten. Der beobachtete Effekt in der Einfach-Behandlung mit 2.5x10-9 M CA-4 beruht auf das Auswaschen der Substanz durch die regelmäßig durchgeführten MWs. Demzufolge stellt sich eine langsame Erholung der klonogenen Aktivität ein. In der Dauer-behandelten Gruppe mit 2.5x10-9 M CA-4 setzt sich jedoch der supprimierende Effekt weiter fort. Unter der Behandlung mit 5x10-9 M CA-4 fällt bereits nach dem ersten Behandlungstag (Tag 4) sowohl für die Einfach- als auch Dauer-Behandlung (s. Tab. 4 und 5) eine komplette Aufhebung der klonogene Aktivität auf. Während bei der Einfach-Behandlung bereits nach einmaligem MW ein Wiedereinsetzen der klonogenen Aktivität zu verzeichnen war, hielt unter der Dauer-Behandlung die vollständige Suppression an.

Um den Wirkmechanismus des Zytostatikums CA-4 in der Proliferationsphase genauer zu betrachten, erfolgte die Untersuchung des Zellzyklusses mit Hilfe der Durchflusszytometrie (s. 2.7 Zellzyklusanalyse). Während die meisten Zellen, sowohl der Kontroll-HASMCs, als auch der behandelten Zellgruppen (Einfach/Dauer: 0.5x10-9 M bzw. 2.5x10-9 M CA-4) sich am Anfang der Beobachtung in der G1-Phase befanden, stellte sich im weiteren Beobachtungsverlauf eine zunehmende Phasenverschiebung zugunsten der G2/M-Phase (s. Tab 10) ein. Im Gegensatz dazu befanden sich bereits zu Beginn der Beobachtungsphase, die mit 5x10-9 M CA-4 behandelten Zellen (s. Tab. 10), mehrheitlich in der G2/M-Phase. In beiden Behandlungsgruppen kam es zu einem verzögerten Shift der Phasenverschiebung in Richtung G1-Phase. So fanden sich mehrheitlich erst am 6. Beobachtungstag der „Einfach-behandelten“ Zellen (s. Tab. 10) in der G1-Phase, wohingegen die Phasenverschiebung in der „Dauer-behandelten“ Zellgruppe erst am 14. Tag zu verzeichnen war. Während jedoch mit der Phasenverschiebung in der „Einfach-behandelten“ Zellgruppe auch mehr Zellen, im Zuge des Substratwechsels und der daraus resultierenden langsamen Erholung, in die S-Phase übergingen, fand sich bei den „Dauer-behandelten“ Zellen (s. Tab. 10) kein vermehrter Übergang in die S-Phase.

Die gewonnenen Daten belegen einen konzentrationsabhängigen Einfluss des CA-4 auf den Wachstumsverlauf der HASMCs. Unter der mittleren Behandlungsdosis (2.5x10-9 M) mit CA-4 ist bereits eine merkliche Reduktion der PK sowie der klonogenen Aktivität zu erkennen, welche sich unter der Einfach-Behandlung langsam auf Kontrollniveau erholt, jedoch unter der Dauer-Behandlung sich stetig auf einem etwas niedrigerem Niveau einpegelt. Unter der Höchstdosis (5x10-9 M) zeigt sich bei „einmaliger Behandlung“ nach anfänglicher kompletter Suppression und anschließend regelmäßig durchgeführten MWs eine stark verlangsamte Erholung sowohl der PK als auch der klonogenen Aktivität. Wohingegen unter der Dauer-Behandlung ein vollständiger Stopp der Proliferationsfähigkeit sowie klonogenen Aktivität zu verzeichnen ist. Die Inhibierung der Zellen durch das CA-4 findet hierbei in der G2/M-Phase statt.

The objective of this dissertation was to investigate the dose-dependent effects of combretastatin A-4 (CA-4) on the growth of human aortic smooth muscle cells (HASMCs). HASMCs play a critical role in the mechanism of restenosis, particularly following percutaneous transluminal angioplasty (PTA). CA-4 belongs to the combretastatin class of tubulin-binding agents. Although structurally similar to colchicine, combretastatins exhibit a higher affinity for colchicine-binding sites on tubulin. By inhibiting microtubule dynamics, they effectively prevent cell growth and proliferation. To evaluate the anti-proliferative effects of CA-4, we employed proliferation kinetics (PK) analysis, colony formation assays (CFA, assessing clonogenic activity), and flow cytometry. For the PK analysis, HASMCs were divided into two treatment groups: a single-dose group (transient exposure) and a continuous-treatment group (sustained exposure). Continuous treatment involved regular media changes (MCs) every 4 days, followed by the re-addition of CA-4. Compared to untreated controls, the lowest dose (0.5 × 10⁻⁹ M; see Fig. 3, Tables 5 and 6) exerted virtually no inhibitory effects on HASMC proliferation in either the single or continuous treatment groups. However, a distinct inhibitory effect emerged at a concentration of 2.5 × 10⁻⁹ M (Fig. 3, Tables 5 and 6). At this dose, cell proliferation decreased markedly, resulting in a flatter growth slope and significantly lower cell counts compared to the control group under both treatment regimens. Both groups reached a plateau, representing a steady-state where cell proliferation balanced cell death, at a reduced cell count level (see Tables 5 and 6). The highest dose of 5 × 10⁻⁹ M (see Fig. 3, Tables 5 and 6) severely suppressed proliferation. Following the scheduled media changes, the single-exposure cells demonstrated a slow recovery trend, though cell counts remained substantially reduced. In contrast, continuous exposure induced a complete growth arrest (see Table 6), maintaining a flat curve at the baseline value of day 0. The growth curve for the single-treatment group followed a significantly flatter, exponential trajectory (see Fig. 3, 5 × 10⁻⁹ M) before transitioning into a plateau phase. Based on these results and the proliferation model (see formula, Sec. 2.5.2), we derived a dose-dependent decrease in cell count per 1 M of CA-4. For both treatment modalities, every 1 M of the CA-4 agent reduced the population by 319,000 cells. The CFA, which evaluates reproductive capacity, revealed that cells treated with 5 × 10⁻¹⁰ M CA-4 (see Figs. 4 and 5, green curve) exhibited a growth trajectory nearly identical to the control group. This was further confirmed by the mean clonogenic scores (see Tables 7 and 8) of both treatment cohorts. The 2.5 × 10⁻⁹ M single-treatment group initially showed a slightly lower curve baseline (see Fig. 4, blue curve 2.5), indicating reduced clonogenic activity. With regular MCs, this curve gradually converged with the control group, reaching baseline clonogenic capacity toward the end of the monitoring period. This trend was also reflected in the absolute colony counts (see Table 7). This recovery in the 2.5 × 10⁻⁹ M single-treatment group is driven by the washout of the substance during routine MCs, allowing clonogenic activity to slowly recover. Conversely, the suppressive effect persisted throughout continuous exposure to 2.5 × 10⁻⁹ M CA-4. At the 5 × 10⁻⁹ M dose, clonogenic activity was completely abolished in both treatment groups after just the first day of exposure (day 4; see Tables 4 and 5). While a single MC was sufficient to restore clonogenic activity in the single-treatment group, complete suppression was maintained under continuous exposure. To elucidate the specific mechanism of action of the cytostatic agent CA-4 during the proliferation phase, we analyzed cell cycle distribution using flow cytometry (see 2.7 Cell Cycle Analysis). At baseline, the majority of cells in both the control and lower-dose groups (0.5 × 10⁻⁹ M and 2.5 × 10⁻⁹ M CA-4) resided in the G1 phase. Over time, however, these cells exhibited a progressive phase shift toward the G2/M phase (see Table 10). In contrast, cells treated with the maximum dose of 5 × 10⁻⁹ M (see Table 10) were predominantly trapped in the G2/M phase from the beginning of the observation window. Both treatment groups eventually showed a delayed shift back toward the G1 phase. The majority of single-treatment cells returned to the G1 phase by day 6 (see Table 10), whereas this phase shift was delayed until day 14 in the continuous-exposure group. Furthermore, while the phase shift in the single-treatment group was accompanied by an increased transition of cells into the S phase—driven by media changes and subsequent recovery—continuously treated cells showed no such increase in S-phase entry (see Table 10). In conclusion, these data demonstrate that CA-4 exerts a concentration-dependent effect on HASMC kinetics. An intermediate dose (2.5 × 10⁻⁹ M) significantly reduces proliferation and clonogenic activity; while transiently exposed cells slowly recover to control levels, continuously exposed cells stabilize at a lower plateau. At the highest dose (5 × 10⁻⁹ M), transient exposure causes severe initial suppression followed by highly decelerated kinetic and clonogenic recovery after regular MCs. Continuous exposure at this dose completely halts both proliferative and clonogenic capacity. This CA-4-mediated cellular inhibition is driven by cell cycle arrest in the G2/M phase.