Mechanisms of Genome Surveillance in Pluripotency

Abstract

Cancer is a leading cause of death worldwide and global numbers of cases are growing rapidly. One third of all cancer deaths can be attributed to exposure to the five leading risk factors tobacco and alcohol consumption, high body mass index, lack of physical activity, as well as low vegetable and fruit intake, which all have been proven to increase concentrations of intracellular reactive oxygen species (ROS). If produced in excess, these highly reactive molecules cause severe damage by oxidizing lipids, proteins and ribonucleic acids, thereby impairing the genomic integrity of the cell. If not repaired correctly, resulting DNA lesions lead to mutations, which in turn can promote tumorigenesis and cancer progression. Maintaining genomic integrity is especially crucial to pluripotent stem cells (PSCs), since they are able to proliferate unlimitedly and to differentiate into cells of all three germ layers. This potential yet also bears the risk of spreading possibly malignant cells throughout the body. However, due to their pluripotency, PSCs also hold great therapeutic potential. To assess the possibilities of clinical use, however, safety issues concerning the maintenance of genomic integrity in PSCs have to be addressed and underlying mechanisms are to be explored thoroughly. This study addresses the question which mechanisms induced PSCs are harnessing to secure their genomic information. Previous work has identified enhanced DNA repair capacities and low apoptosis thresholds in PSCs. This study shows that induced pluripotent stem cells (iPSCs) rapidly undergo apoptosis upon genotoxic stimulation. Contrarily to previous reports, this readiness to undergo apoptosis is attributed to a low apoptosis-threshold due to low expression of anti-apoptotic proteins (mitochondrial priming) rather than pre-activated pro-apoptotic BAX. Further a novel, additional mechanism of securing genomic information is identified: The novel long-run RT-PCR based DNA damage quantification (LORD-Q) method is utilized to measure DNA damage and to reveal a decreased DNA damage susceptibility of human iPSCs in comparison to parental fibroblasts as well as other cell lines. Human iPSCs are demonstrated to hold a cell-type specific enhancement of the antioxidative defense system, which significantly reduces ROS-induced DNA damage. The antioxidative molecule glutathione (GSH) and the GSH-dependent glutathione peroxidase 2 (GPX2) are identified as two key players in this mechanism of DNA protection. Furthermore this study extends the applicability of the LORD-Q method by providing the possibility of simultaneous measurement of the mitochondrial copy number and DNA damage. This new implementation is made use of to examine the influence of the mitochondrial DNA (mtDNA) copy number on DNA damage susceptibility. Damaged mtDNA is shown to be degraded upon genotoxic insults, followed by a phase of hyper-compensatory DNA replication. Higher amounts of mitochondrial DNA however are revealed to only provide protection against genotoxic UV radiation, but not in a general way. Lastly, the extended LORD-Q method is demonstrated to be suitable for analysis of tissue samples, thereby providing a tool for a broad range of research. In summary this study reveals some of the fundamental mechanisms of genome surveillance and by extending the applicability of the LORD-Q assay provides a novel, powerful multiplex tool to further work in a broad field of research.

Krebserkrankungen stellen weltweit eine der häufigsten Todesursachen dar, wobei die Zahl der Krebserkrankten stetig ansteigt. Ein Drittel aller Krebstode lässt sich auf die fünf Risikofaktoren Tabak- und Alkoholkonsum, mangelnde Bewegung, zu geringer Konsum von Gemüse und Obst sowie einen zu hohen body mass index zurückführen. Jeder dieser Faktoren erhöht nachweislich die intrazellulären Konzentrationen reaktiver Sauerstoffspezies (ROS). Im Überschuss vorhanden, können diese Moleküle beträchtlichen Schaden in lebenden Zellen anrichten, indem sie Lipide, Proteine oder DNS-Basen oxidieren. Wird das so geschädigte Genom nicht vollständig und korrekt repariert, können Mutationen entstehen, die zur Tumorgenese oder zum Fortschreiten der Krankheit beitragen können. Von besonderer Bedeutung ist in diesem Zusammenhang die Sicherung der genetischen Integrität für pluripotente Zellen. Diese Stammzellen sind in der Lage sich unlimitiert zu teilen und in Zellen aller drei Keimblätter auszudifferenzieren. Diese Fähigkeit birgt jedoch auch das Risiko, dass gegebenenfalls auftretende Entartungen vergleichsweise schnell über den ganzen Organismus zu streuen vermögen. Durch ihre Pluripotenz verfügen Stammzellen über ein enormes therapeutisches Potenzial. Bevor jedoch ein klinischer Einsatz in Erwägung gezogen werden kann, ist es unerlässlich etliche Sicherheitsfragen bezüglich der Gewährleistung der genetischen Stabilität dieser Zellen zu beantworten und die zugrundeliegenden, noch unzureichend erforschten Mechanismen aufzuklären. Aus diesem Grunde befasst sich diese Studie mit der Fragestellung welche Mechanismen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS) zur Verfügung stehen, um ihre genomische Integrität zu wahren. Früheren Studien zufolge verfügen Stammzellen über eine erhöhte DNS-Reparaturkapazität sowie eine geringe Apoptose-Hemmschwelle. Letzteres wurde auf pro-apoptotisches, prä-aktiviertes BAX zurückgeführt, welches zum Golgi-Apparat transloziert werde. Diese Arbeit bestätigt die schnelle Apoptoseinduktion der iPS-Zellen, widerlegt jedoch die bisherige Begründung und weist stattdessen als Auslöser eine geringe Apoptose-Hemmschwelle aufgrund geringer Konzentrationen anti-apoptotischer Proteine nach. Außerdem wird erstmals ein zusätzlicher Mechanismus zum Schutz der genetischen Information in iPS-Zellen identifiziert: Mittels der neuen RT-PCR basierten Methode zur DNA-Schadensquantifizierung LORD-Q wird die DNS-Schadensanfälligkeit von humanen iPS-Zellen untersucht und gezeigt, dass mit dem Status der Pluripotenz eine reduzierte Anfälligkeit gegenüber genotoxischen Stimulanzien einhergeht. Der zu Grunde liegende Mechanismus wird aufgeklärt und gezeigt, dass erhöhte Level des antioxidativen Moleküls Glutathion und der Glutathionperoxidase 2 hauptverantwortlich für die zelltypspezifische ROS-Abwehr in humanen iPS-Zellen sind.

Des Weiteren erweitert diese Studie die LORD-Q Methode um die Möglichkeit einer simultanen Messung von DNA-Schäden und der mitochondriellen Kopienzahl. Diese Weiterentwicklung der Methode wird genutzt, um den Einfluss der Kopienzahl des mitochondriellen Genoms auf dessen Anfälligkeit gegenüber genotoxischen Schäden zu untersuchen. Es wird gezeigt, dass geschädigte mitochondrielle DNS abgebaut wird, worauf eine hyperkompensatorische DNS-Replikation folgt. Eine größere Menge mitochondrieller DNS pro Zelle, scheint diese zwar teilweise vor UV-Strahlung zu schützen, jedoch nicht mit einem generell höheren Schutz der DNS verknüpft zu sein. Zudem wird die erweiterte LORD-Q Methode an Gewebeproben etabliert und ihre Funktionalität demonstriert, was ihre Anwendbarkeit auf viele weitere Forschungsbereiche ausweitet. Zusammengefasst entschlüsselt die vorliegende Studie grundlegende Mechanismen zur Erhaltung der genomischen Stabilität und etabliert durch die Weiterentwicklung der LORD-Q Methode ein neues und vielseitig einsetzbares Werkzeug für zukünftige Forschungsprojekte.