Funktionsstudien mit dem in situ mono-ubiquitinierten peroxisomalen Importrezeptor PEX5

Abstract

:Der Importrezeptor PEX5 ist für die peroxisomale Biogenese essentiell. Er versorgt die Peroxisomen mit den notwendigen Enzymen, um deren Funktion aufrecht zu erhalten. Die peroxisomalen Matrixproteine werden im Zytosol an den freien Ribosomen synthetisiert und von PEX5 durch ihre peroxisomale Erkennungssequenz (PTS1 oder PTS2) gebunden. Der PEX5-Matrixproteinkomplex wird zur peroxisomalen Membran transportiert und bindet dort an den membranverankerten Dockingkomplex (PEX13/PEX14). Anschließend erfolgt die Insertion von PEX5 in die peroxisomale Membran, wobei zeitgleich die Translokation durch die Membran und Freilassung des Matrixproteins in das Peroxisom erfolgt. Im nächsten Schritt wird PEX5 am N-terminalen konservierten Cystein monoubiquitiniert (mUb-PEX5) und ATP-abhängig durch die Exportmaschinerie (PEX26, PEX1/PEX6) aus der Membran gezogen. Nach der Deubiquitinierung kann ein neuer Zyklus von PEX5 stattfinden. In dieser vorliegenden Arbeit sollten folgende Aspekte untersucht werden: 1) Inwiefern kann mUb-PEX5 den PEX5-Zyklus aufrechterhalten? 2) Findet eine direkte Interaktion zwischen mUb-PEX5 und der Exportmaschinerie statt? Zur Beantwortung dieser Fragestellung war es zunächst notwendig, mUb-PEX5 in größeren Mengen zur Verfügung zu haben. Eine rekombinante Gewinnung von mUb-PEX5 wurde in der Literatur bisher nicht beschrieben. Diese Gewinnung wurde im ersten Schritt unter Verwendung der Klickchemie etabliert. Zunächst wurde durch eine Nonsense-Suppression in PEX5 die unnatürliche Aminosäure p-Azidophenylalanin (AzF) anstelle des konservierten N-terminalen Cysteins eingebaut (PEX5C11AzF). Im weiteren Schritt wurde Ubiquitin (Ub(ΔGG)) rekombinant exprimiert und durch Inteinspaltung zu einem Ub(ΔGG)-Alkin generiert. Aus beiden Komponenten konnte durch eine Kupferkatalytische Klickreaktion ein stabiles rPEX5-Ub(ΔGG) hergestellt werden. Es konnte in in vitro und in vivo Versuchen gezeigt werden, dass rPEX5-Ub(ΔGG) nicht an PTS1-Proteine binden, jedoch PTS2-Proteine in die Peroxisomen transportieren kann. rPEX5-Ub(ΔGG) ist in der Lage, an den Dockingkomplex zu binden und in die peroxisomale Membran zu inserieren. rPEX5-Ub(ΔGG) und die PTS2- Matrixproteine erlangen somit einen Protease-geschützten Status. Es ist stark anzunehmen, dass rPEX5-Ub(ΔGG) durch den Exportkomplex aus der Membran entfernt werden kann. In vitro Interaktionsstudien zeigen, dass rPEX5-Ub(ΔGG) gleichermaßen wie rPEX5L an PEX14 binden kann und dass diese Bindung durch die Anwesenheit des Exportkomplexes nicht beeinflusst wird. Aus den Versuchen geht auch hervor, dass rPEX5-Ub(ΔGG) stets besser an die Exportproteine binden kann als das normale rPEX5 (rPEX5L). Eine Interaktion zwischen PEX26 und rPEX5-Ub(ΔGG) konnte erstmals gezeigt werden. In weiteren Studien konnte eine Bindung zwischen PEX14 und PEX26 nachgewiesen werden, die in Anwesenheit von rPEX5-Ub(ΔGG) verstärkt wurde. Eine Analyse zur Faltung mittels einer limitierten Proteolyse der rekombinanten Proteine ergab, dass der N-Terminus im Vergleich zum C-Terminus von rPEX5L instabil und damit vermutlich weniger gefaltet ist. Im Unterschied dazu weist der N-Terminus von rPEX5-Ub(ΔGG) drei stabile Bereiche auf, die möglicherweise durch die Ubiquitinierung geschützt werden. Der C-Terminus in rPEX5-Ub(ΔGG) ist hingegen instabiler und wird zunehmend abgebaut. Die in dieser Arbeit beschriebene Herstellung von rPEX5-mUb(ΔGG) ermöglichte eine Vielzahl von Interaktionsstudien, durch die neue Aspekte der PEX5-Importmaschinerie gewonnen werden konnten. Dadurch wurde eine Ausgangsbasis für weitere Einblicke in die Peroxisom-Biogenese geschaffen. Weitere Studien könnten darauf aufbauend beispielsweise klären, inwiefern mUb-PEX5 mit dem PEX1/PEX6-Komplex interagiert und ob es sich hierbei um direkte oder indirekte Interaktionen handelt.