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Erkrankungen der Leber sind, neben Herzkreislauferkrankungen, die häufigsten chronischen Erkrankungen älterer Menschen. Große Häufigkeiten haben speziell die beiden Krankheitsentitäten Leberfibrose und Leberzirrhose. Bis dato stellen 2D-Modelle den Goldstandard für in vitro - Toxizitätsstudien an primär humanen Hepatozyten (pHH) dar. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Etablierung eines in vitro - Modells zur Untersuchung des Einflusses der Extrazellulären Matrixsteifigkeit (ECM) auf den Hepatozyten – Metabolismus. Ziel ist vor allem die Entwicklung eines Modells, das den in vivo - Zustand einer Leber besser abbildet. Das 2D-Modell entspricht nicht den in vivo - Bedingungen, da eine gesunde Leber eine Steifigkeit von 3-6 kPa, die 2D-Kultur hingegen eine solche im Bereich von Giga-Pascal aufweist. Bei chronischen Lebererkrankungen, wie der Leberfibrose und Leberzirrhose, steigt die Steifigkeit des Organs entsprechend der Krankheitsprogression an (gesunde Leber 3,5 kPa, fibrotische Leber 8,2 kPa, zirrhotische Leber 24 kPa). Um die Auswirkungen der ECM-Steifigkeit auf die Physiologie der pHH unter den Bedingungen einer gesunden, fibrotischen und zirrhotischen Leber zu untersuchen, wurde ein Kultivierungsmodell basierend auf Polyacrylamid (PAA) entwickelt. Als Vergleichsmodelle dienen das 2D- (Collagen Monolayer) und das herkömmliche 3D-Modell (Collagen Sandwich). Die Steifigkeit der PAA-Gele wurde mit Hilfe des Atomic-Force-Mikroskops validiert.
In einem weiteren Schritt wurde unter den neuen Bedingungen an der HuH-7 Leberkrebszelllinie die Biokompatibilität der PAA-Gele mit Hilfe von LDH und AST überprüft. Als zusätzliche Parameter wurden der Glukose- und der Harnstoffmetabolismus getestet, um eine Aussage darüber zu treffen, inwieweit physiologische Funktionen der Hepatozyten erfüllt werden. Schließlich wurde an Tag 1 die morphologische Veränderung der HuH-7 Zellen mit Hilfe von IF-Farbstoffen dargestellt. Neben der Testung der PAA-Modelle an HuH-7 Zellen wurden die neuen Modelle auch anhand primärer Rattenhepatozyten und anschließend mit pHH getestet. Bei den primären Rattenhepatozyten wurden,außer den morphologischen Veränderungen, die gleichen Parameter wie bei den HuH-7 Zellen überprüft. Bei den pHH erfolgte des Weiteren die Überprüfung der Parameter Albumin, Resazurin. Die Fähigkeit zur Biotransformationsfähigkeit wurde anhand der Transporteraktivitäten und Cytochrom P 450 - Genexpressionen überprüft.
Auf den PAA-Gelen zeigten alle drei Zellarten eine gute Zellviabilität und keinen erhöhten hepatozellulären Schaden gegenüber den Vergleichsmodellen, 2D- und reinem 3D-Modell. Bei der Metabolisierung von Glukose und Harnstoff wurden deutliche Unterschiede der primären Hepatozyten zu den HuH-7 Zellen sichtbar. Speziell bei den pHH konnte auf den PAA-Modellen eine erhöhte Harnstoff- und Albumin-Produktion beobachtet werden. Zudem sind die Transporter MRP-1 und MDR-1 aktiver und die Cytochrom P 450 - Enzyme zeigen auf den PAA-Gelen signifikante Expressionsunterschiede zum 2D-Modell. Mit Hilfe von Immunfluoreszenz-Färbungen konnte in den HuH-7 Zellen und in den pHH eine proportionale Steigerung der Stressfasern verbunden mit der Erhöhung der Steifigkeiten nachgewiesen werden. Auch eine verstärkte Ausbildung von Gallengangskanälchen im 3D-Modell (Collagen Sandwich) und in den PAA-Modellen war signifikant.
Mit den Tests anhand der neu entwickelten PAA-Modelle konnte nachgewiesen werden, dass der Metabolismus der Hepatozyten bereits allein durch die Änderung der ECM-Steifigkeit beeinflussbar ist und dass es möglich ist, mit diesen neuen in vitro Modellen näher an den in vivo Zustand der Leber zu kommen. Dennoch gilt es, die Hepatozyten auf den neuen Modellen mit Hilfe von Toxizitätstests weiter zu überprüfen und die beiden Krankheitsentitäten nicht nur durch die veränderte Matrixsteifigkeit darzustellen, sondern beispielsweise durch Versuche unter Zugabe von Interleukinen / Zytokinen zu ergänzen. |
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