BiTE Antikörper-Konstrukte zur Therapie von Influenza A- und Cytomegalovirus-Infektionen

Abstract

Bispezifische T-Zell-rekrutierende Antikörper-Konstrukte, auch BiTE Antikörper-Konstrukte (BiTE AKs) genannt (von bispecific T cell engaging antibody constructs), konnten in klinischen Studien bereits erfolgreich zur Behandlung verschiedener Formen von Krebs eingesetzt wer-den. Sie besitzen zwei Bindungsstellen mit unterschiedlichen Spezifitäten und binden so zum einen spezifisch an ein bestimmtes Protein auf der Oberfläche von Zielzellen, zum anderen an CD3ε, welches auf der Oberfläche aller T-Zellen vorkommt. Durch die so zustande kom-mende enge Bindung von T-Zellen an Zielzellen kommt es zur Ausbildung immunologischer Synapsen und zur Lyse der Zielzellen. In dieser Arbeit wurden auf der Grundlage muriner Antikörper-Spezifitäten BiTE AKs generiert, deren Zielprotein-bindende Anteile die Extrazel-lulär-Domäne des Influenza A-Matrixproteins 2 (M2e) oder das Cytomegalovirus Glykopro-tein B (gB) binden. Es konnte gezeigt werden, dass diese BiTE AKs in der Lage sind, die spezi-fische Lyse von Zellen zu vermitteln, die diese Proteine auf der Oberfläche tragen. Um BiTE AKs zu erhalten, deren M2e- bzw. gB-bindende Anteile eine Aminosäuresequenz aufweisen, die eine hohe Ähnlichkeit zur humanen Keimbahnsequenz, und dadurch ein geringeres im-munogenes Potential, besitzt, wurden die sich unterscheidenden Aminosäuren in den Framework-Regionen der murinen Sequenz, wenn möglich, gegen die Aminosäuren ausge-tauscht, die in der humanen Keimbahnsequenz an diesen Positionen vorkommen. Die resul-tierenden human-ähnlichen (human-like) M2e- und gB-bindenden einzelkettigen variablen Fragmente (scFvs) mit den besten Eigenschaften wurden als komplette BiTE AKs exprimiert, aufgereinigt und charakterisiert. Die so generierten human-like M2e BiTE AKs besaßen M2e-bindende Anteile, die bis zu 87,3 % identisch mit der humanen Keimbahnsequenz wa-ren (muriner Binder: 78,2 %). Der Großteil der human-like M2e BiTE AKs wies eine höhere Affinität zu M2e, sowie eine höhere zytotoxische Aktivität im Vergleich zum murinen M2e BiTE auf, obwohl die Sequenzen der CDRs (complementarity determining regions) nicht ver-ändert wurden. Mit unterschiedlichen Influenza A-Virusstämmen infizierte Zellen wurden in einem in vitro Zytotoxizitäts-Assay durch einen human-like M2e BiTE mindestens 5-fach besser lysiert, als durch das murine Molekül. Im Maus-Modell konnte außerdem gezeigt werden, dass die Tiere durch eine Behandlung mit human-like M2e BiTE vor dem tödlichen Verlauf einer Influenza A-Infektion geschützt waren, während die Behandlung mit dem gleich dosierten murinen M2e BiTE nur zum Teil schützend wirkte. Die generierten human-like CMV-gB BiTE AKs besaßen gB-bindende scFv-Anteile, die bis zu 85,9 % identisch mit der humanen Keimbahnsequenz waren (muriner Binder: 66,8 %). Die human-like CMV-gB BiTE AKs hatten eine vergleichbar hohe Aktivität in in vitro Zytotoxizitäts-Assays, wie der murine CMV-gB BiTE. Da CMV-gB und Influenza A-M2 sowohl hoch spezifisch für infizierte Zellen, als auch hoch konserviert zwischen verschiedenen Virusstämmen sind, könnten die unter-suchten BiTE AKs ein vielversprechender Ansatz für die Behandlung dieser viralen Erkran-kungen sein. Die in der vorliegenden Arbeit gezeigten Ergebnisse zeigen zudem, dass BiTE AKs nicht nur in der Onkologie erfolgreich eingesetzt werden können, sondern ein Einsatz auch in dem breiten Feld der Infektionserkrankungen erfolgversprechend erscheint.

Bispecific T cell engaging (BiTE) antibody constructs (ACs) have already been used to suc-cessfully treat different types of cancer in clinical trials. They possess two different binding sites. One binding site is specific for a certain target protein expressed on a diseased cell and the other is specific for CD3ε, which is expressed on all T cells. The resulting binding of T cells to target cells leads to the formation of immunological synapses and target cell lysis. In this thesis, different BiTE ACs were generated with target protein binding moieties based on the amino acid sequences of the variable fragments of murine antibodies specific for the extracellular domain of the Influenza A matrix-protein 2 (M2e) or the Cytomegalovirus gly-coprotein B (gB). It could be shown that these BiTE ACs are able to redirect T cells to bind and lyse cells carrying these proteins on the cell surface. To obtain BiTE ACs with M2e- or gB-binding moieties with a high similarity to the human germline amino acid sequence, resulting in a lower immunogenic potential of the antibody, the differing amino acids in the framework regions of the murine sequence were replaced by the respective human amino acids, if possible. The resulting human-like M2e- or gB-binding single-chain variable frag-ments (scFvs) with the best properties were converted into complete BiTE ACs which were expressed, purified and characterized. The generated human-like M2e BiTE ACs had M2e-binding moieties which displayed up to 87.3% identity to the human germline sequence (original murine binder: 78.2%). Most of the human-like M2e BiTE ACs showed higher affini-ties for M2e and higher cytotoxic activities, compared to the murine M2e BiTE, although the amino acid sequences of the complementarity determining regions (CDRs) had not been changed. Cells infected with different strains of Influenza A virus were lysed at least 5 times more potently by a human-like M2e BiTE, compared to the murine molecule. Moreover, a human-like M2e BiTE was able to protect mice infected with a potentially lethal dose of a mouse-adapted Influenza A strain from death, while mice treated with the same dose of the murine M2e BiTE were only partly protected. The human-like CMV-gB BiTE ACs had gB-specific moieties which exhibited up to 85.9% identity to the human germline sequence (murine gB-binding moiety: 66.8%). Compared to the murine CMV-gB BiTE, human-like CMV-gB BiTE ACs proved to be similarly effective in in vitro cytotoxicity assays. With Influ-enza A-M2 and CMV-gB being highly specific for virus-infected cells as well as highly con-served among different viral strains, the examined BiTE ACs could be a promising approach for the treatment of these two viral diseases. Moreover, the results presented in this thesis indicate a therapeutic potential of BiTE ACs beyond oncology, e.g. in the broad field of infec-tious diseases.